目的宮頸癌(Cervical cancer)是目前國內婦科最常見的惡性腫瘤,嚴重影響了女性健康。它具有較強轉移性和預后復發(fā)率高等特點。目前臨床上多采取藥物治療作為保守療法,但隨著治療周期延長,極易產生耐藥性。因此,找出抑制耐藥恢復藥物敏感性的方法,從而對病情有效控制顯得尤為重要。宮頸癌細胞表面的P-糖蛋白(P-gp)表達水平遠高于正常細胞,且體內P-gp含量高的宮頸癌患者更容易產生耐藥。這表明減少P-糖蛋白的過度表達可能成為克服宮頸癌耐藥的關鍵。MDR1是P-gp的編碼基因,因此靶向靜默MDR1將有效減少P-gp表達。吉非替尼(Gefitinib),是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制劑,在臨床上曾經用于治療非小細胞癌,隨著對其性質和藥理機制的深入研究,現(xiàn)在吉非替尼也被廣泛應用于宮頸癌的治療,但是耐藥現(xiàn)象的產生嚴重限制了吉非替尼的抗腫瘤作用。因此本課題擬利用小干擾RNA即shMDR1對耐藥基因進行靜默,減少P-gp的表達,抑制耐藥的發(fā)生,使耐吉非替尼宮頸癌Hela細胞株重新獲得對吉非替尼的敏感性。本研究設計并制備殼聚糖納米粒將原料藥吉非替尼與shMDR1基因共同包裹于納米粒中,實現(xiàn)基因和抗腫瘤藥物的共傳遞�？疾旃草d納米粒的穩(wěn)定性及表征,分析共載納米粒對吉非替尼耐藥細胞株的增殖、凋亡作用影響,初步探究細胞對shMDR1和吉非替尼共載納米粒攝取機制。證明殼聚糖包載吉非替尼與shMDR1將具有克服腫瘤耐藥的潛質,增加化療效果。方法本實驗首先利用紫外吸收光度法建立吉非替尼的含量測定方法,并對方法的線性、重復性、穩(wěn)定性和回收率等進行考察。采用離子交聯(lián)法將吉非替尼與shMDR1共包載于材料殼聚糖中,制備成殼聚糖納米粒。對制備的共載納米粒進行表征分析,包括外觀、形態(tài)、粒徑,同時對納米粒的體外釋放度及長期穩(wěn)定性進行考察。通過凝膠阻滯、血清保護實驗和酶解實驗考察殼聚糖對所包裹質粒shMDR1的保護作用。激光共聚焦顯微鏡觀察shMDR1與吉非替尼共載納米粒在細胞內的分布情況。通過攝取實驗分析細胞攝取共載納米粒方式。對共載納米粒的體外抗腫瘤活性進行考察。運用MTT法初步探究shMDR1與吉非替尼共載納米粒對宮頸癌細胞增殖作用影響。流式細胞術分析shMDR1與吉非替尼共載納米粒對細胞凋亡影響。Western blot實驗檢測共載納米粒對細胞凋亡和自噬相關蛋白的表達情況。結果建立的吉非替尼原料藥shMDR1含量測定方法線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性和回收率均符合方法學要求,故測定方法可用于吉非替尼與shMDR1的體外含量測定。篩選出制備shMDR1與吉非替尼共載納米粒的最佳處方,所制備的納米粒大小均勻,透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)呈緊致球形,分散性良好。包封率結果顯示所選擇的處方能夠很好的將兩者包封于納米粒中。吉非替尼包封率為89.8%±7.1%,shMDR1為88.3%±7.2%。共載殼聚糖納米粒的釋放呈現(xiàn)pH依賴性,在pH為5.8條件下吉非替尼迅速釋放,但在pH為7.4條件下釋放緩慢,shMDR1在納米粒中的釋放行為與吉非替尼相比沒有顯著差異,在48 h時shMDR1在兩種pH條件下的累計釋放率均約為75%,體現(xiàn)兩者均能從納米粒中很好的釋放到緩沖液。激光共聚焦顯微鏡觀察到共載殼聚糖納米粒能夠富集到細胞核周圍,且富集行為呈時間和劑量依賴性。攝取實驗能夠證明細胞對共載納米粒的攝取與網格蛋白介導作用相關,通過加入多種抑制劑初步揭示納米粒在細胞內的轉運呈能量依賴性。MTT與流式結果分析顯示shMDR1與吉非替尼共載納米粒能夠抑制宮頸癌細胞增殖,具有較強的細胞毒性,能夠誘導細胞顯著增加凋亡。Western blot實驗結果表明共載殼聚糖納米粒能顯著增加細胞Cleaved caspase-3的表達,同時遞送的shMDR1能夠減少MDR1的含量,證明共載納米粒能夠逆轉MDR1介導的耐藥機制。結論本研究成功制備了共載shMDR1與吉非替尼的殼聚糖納米粒,所制備的共載納米粒具有大小均勻,形態(tài)呈球形,分散性良好,呈pH依賴性釋放的特點。殼聚糖作為本文的納米載體能夠有效保護質粒與藥物在血清、酶存在環(huán)境下避免被降解。共載納米粒對耐吉非替尼的Hela細胞有明顯的抑制增殖作用,其機制是shMDR1進入細胞后,阻斷耐藥基因MDR1的表達,導致P-gp表達減少,逆轉耐藥,使耐藥細胞株Hela恢復對吉非替尼的敏感性,這將有利于在不遠的未來,納米技術應用于基因工程發(fā)揮更大的作用,創(chuàng)造更多的價值。
【學位單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

吉非替尼紫外可見光譜掃描圖

圖 1B 殼聚糖紫外可見光譜掃描圖非替尼標準曲線的繪制 結果所示，X 軸是吉非替尼標準品濃度 C，Y 軸是吸光度繪制成標準曲線，得到回歸方程 A=0.0212C+0.023，相

可以排除其對吉非替尼含量測定的干擾。圖 1A 吉非替尼紫外可見光譜掃描圖圖 1B 殼聚糖紫外可見光譜掃描圖2、吉非替尼標準曲線的繪制如圖 2 結果所示，X 軸是吉非替尼標準品濃度 C，Y 軸是吸光度 A，根據所得檢測結果繪制成標準曲線，得到回歸方程 A=0.0212C+0.023，相關系數 r＝0.9991，說明吉非替尼質量濃度在 1～50 μg/mL 內線性關系良好。
【參考文獻】

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本文編號：2890269