發(fā)布時間：2020-11-19 23:32

　　 目前,新藥尤其是抗生素,急切需要解決病原體抗性的問題,其中大自然擁有最豐富的新抗生素來源,因此,從天然資源中尋找具有顯著生物活性的天然產(chǎn)物仍然是發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物的主要途徑。此外,抗生素在生物工程合成領(lǐng)域和化學(xué)合成領(lǐng)域也有相當(dāng)大的進(jìn)步。海洋為海洋生物提供了巨大而多樣的棲息地。海洋因其具有不斷變化的溫度,壓力,鹽度和金屬濃度等因素,使得成為海洋植物和藻類產(chǎn)生新化合物的環(huán)境來源。獨(dú)特的海洋環(huán)境中生長著種類繁多的海洋植物和藻類,這些生物能產(chǎn)生很多具有生物活性的天然產(chǎn)物,不少是在陸地上不曾發(fā)現(xiàn)的。獨(dú)特的海洋生物使得海洋天然產(chǎn)物具有顯著多樣性。近幾十年來,海洋天然產(chǎn)物因其多樣的生物活性和用途而備受關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報道,已從海洋來源中分離出16000個天然產(chǎn)物,包括萜類化合物、甾體化合物、酚類化合物、生物堿-多糖復(fù)合物、多肽類化合物、聚酮類化合物、脂肪酸類化合物和甘油類化合物,到目前為止有6800篇出版物。海洋環(huán)境中包含數(shù)量眾多的微觀和宏觀有機(jī)體種類,特別是海洋植物和藻類被證實(shí)具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的次級代謝產(chǎn)物的能力。植物在海洋世界中,在耐火生物材料的再循環(huán)上發(fā)揮重要的生態(tài)作用,并且在藥學(xué)應(yīng)用中能夠生產(chǎn)新穎的次級代謝產(chǎn)物。盡管海洋微生物能產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物,它被認(rèn)為是抗生素的頂級生產(chǎn)者,同時也是制藥工業(yè)的重要提供者,但在生產(chǎn)抗生素的總量上,海洋植物占最大份額。海洋植物生長于各種環(huán)境中,其中不乏有生存壓力,并且它們有能力產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物也是眾所周知的。因此,海洋生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和酶反應(yīng)系統(tǒng)與陸地生物相比有著巨大的差異,導(dǎo)致海洋生物往往能夠產(chǎn)生一些化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣、顯著的先導(dǎo)化合物,為新藥研究提供大量的模式結(jié)構(gòu)和藥物前體。海洋是地球上最具多產(chǎn)的生態(tài)環(huán)境,生長其中的植物次級代謝產(chǎn)物具有相當(dāng)高的多樣性。自早些時候以來,許多研究人員著眼與從陸地到海洋或淡水的藻類化學(xué)成分,尤其是綠藻類,它們有望在營養(yǎng)品和制藥行業(yè)中被開發(fā)利用為功能活性物質(zhì);在廣泛的陸生植物上研究了這些綠藻代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)。這些來自綠藻次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分,已經(jīng)在大量陸生植物中進(jìn)行了研究。綠藻門(Chlorophyta)植物種類繁多,含有約4300個物種,其次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有多樣性,部分含有特定來源的特征性的功能基團(tuán)。綠藻中所有具有生物活性的化合物如生物堿、萜類、類固醇、脂肪酸、甘油酯和多糖都因其具有膳食營養(yǎng)補(bǔ)充和藥理活性而備受關(guān)注。營養(yǎng)微藻是一類種類繁多的微小植物,其包含介于50-70%之間相對高含量的蛋白質(zhì)(畜肉蛋白含量為50%和小麥為15%-17%),30%的脂類,40%的甘油,以及平均含量較低的胡蘿卜素(8%-14%)和維生素(B1、B2、B3、B6、B12、E、K、D等)。與其他植物或動物相比,微藻的生理和生物化學(xué)特征有較大不同,并且藥用的藻類與其提取物具有不同程度的生物活性。其中包括抗腫瘤、抗原生動物、抗病毒、抗氧化劑、抑制人癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。在綠藻門(Chlorophyta)中,剛毛藻屬(Cladophora)在分類學(xué)上較復(fù)雜,其包含許多種,有不少已被化學(xué)和藥學(xué)研究。在這項研究中,我們選擇了兩個樣本,其兩種是收集來自中國東南部舟山的沿海植物,旋花濱Calystegia soldalla、蓬蘽 Rubus hirsutus thunb以及來自同一地區(qū)的綠藻Cladophora stempsonii。這項研究的目的是從和旋花濱和綠藻的次級代謝產(chǎn)物中,分離純化得到具有生物活性的化合物。本論文的研究內(nèi)容包括從旋花濱和綠藻中獲取次級代謝產(chǎn)物。在我們項目組的努力下,通過使用不同的有機(jī)試劑去鑒別具有活性的化合物,以尋找抗生素以及其他來自海洋植物和藻類的具有藥用和營養(yǎng)價值的化合物。隨后,對三種樣品的具有生物活性的新化合物進(jìn)行評估和表征。旋花濱Calystegia soldanella、蓬蘽和綠藻Cladophora stempsonii使用3種不同的有機(jī)試劑提取;首先利用80%乙醇溶液提取浸膏,隨后用水將浸膏進(jìn)行分段,隨后依次使用乙酸乙酯和正丁醇對浸膏進(jìn)行提取。使用TLC在內(nèi)的不同色譜技術(shù)對旋花濱Caalstegia soldnella和綠藻Cladophora stempsonii進(jìn)行了研究和分離純化。純品化合物采用HPLC、UV和NMR鑒別。來自旋花濱Calysyegiasoldanella的化合物利用平板稀釋法對綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、金黃色葡萄球菌 Saphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 以及大腸桿菌Escherichiacoli進(jìn)行了抑菌試驗。除了抑菌試驗,同時對化合物的抗氧化性(DPPH、FRAP)進(jìn)行了測定。來自綠藻(Cladophora stempsonii)的化合物采用96孔板對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(Escherichia coli)進(jìn)行了抑菌試驗。將抑菌性較強(qiáng)的3個來自綠藻Cladophora stempsonii化合物命名為1、2和3號。其中對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(KlKbsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Eshherichia acoli)、枯草芽孢桿菌(Baacillus subtilis)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的最低抑菌濃度為 4.0 μg/mL、1.0 μg/mL、0.2 μg/mL、4.0 μg/mL 和 4.0μg/mL�；�合物2對前4種病原菌的最低抑菌濃度分別為8μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和32.0μg/mL,對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)沒有抑制活性�；�合物3僅對3種病原菌有抑制作用,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)最低抑菌濃度分別為64μg/mL、32 μg/mL和16 μg/mL。分離純化來自于綠藻的化合物1通過1D-NMR和2D-NMR鑒定為膽固醇,通過2D-NMR鑒定化合物2為N-Phenethylisovaleramide以及醫(yī)用GC-MS對綠藻中低極性的組分進(jìn)行測定。旋花濱(Calystegia soldanella)和綠藻(Cladophora stempsonii)的正丁醇相浸膏利用TLC、柱色譜和Pre-HPLC進(jìn)行了分離純化。因為化合物量少而無法確定所有純品化合物結(jié)構(gòu)。植物內(nèi)生真菌是寄生在健康植物組織和各器官內(nèi)部,并不引起寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌。在進(jìn)化中,因其次生代謝產(chǎn)物可與寄主形成了內(nèi)在聯(lián)系,還可以利用寄主代謝產(chǎn)物為前體,經(jīng)自身轉(zhuǎn)化成為新成分。內(nèi)生真菌資源豐富,但至今的研究不夠全面,仍存在許多問題待解決。堿蓬(Suaedaglauca)為藜科堿蓬屬植物,是一種耐鹽的植物,易于在沿海地區(qū)或湖邊形成單優(yōu)群落。有研究表明,堿蓬屬植物不同時期抗氧化活性與其總黃酮類物質(zhì)含量相關(guān),但其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗氧化活性和抑菌活性鮮有報道。在本研究中,利用平板劃線法從健康、無病蟲害的堿蓬中篩選的一株曲霉(Aspergillus TQ67),經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,首先用乙酸乙酯萃取得到粗提物,隨后利用制備反相柱(甲醇和水),從中得到含量最大的組分(化合物)。利用TLC判斷不同溶劑的配比。利用HPLC-MS、NMR和2D-NMR鑒別出新化合物。這些經(jīng)鑒定的8個化合物包括:aspermutarubrol(1)、Sydowiols D(2)、sydowiol E(3)、L-tenuazonic acid(4)、(E)-5-(hydroxymethyl)-2-(6'-methylhept-2'-en-2'-yl)phenol(5)、sydonol(6)、(7S)-(+)-7-O-methylsydonol(7)和 hydroxyl-sydonic acid(8)。同時對這些化合物的抗氧化性(DPPH)進(jìn)行了測定,其中化合物2、3和化合物1DPPH的IC50分別為(9.79±0.33)和(32.30±1.02)μg·mL-1,表明其具有較好的抗氧化活性。一般認(rèn)為,海洋植物和藻類隨著時間的推移,進(jìn)化出各種機(jī)制,使它們能夠抵抗生物和非生物脅迫,以維持它們正常的生理功能。隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,有發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物在海洋植物和藻類適應(yīng)環(huán)境的過程中起著重要的作用。已經(jīng)證實(shí)許多化合物是非生物和生物因素下合成的應(yīng)激產(chǎn)物,這些因素包括病原體攻擊、高重金屬濃度、干旱、鹽度、創(chuàng)傷,輻射或高可見光強(qiáng)度,以及其他關(guān)注度較低的因素。一些研究表明,不同的有機(jī)溶劑不僅能刺激海洋植物和藻類的次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,而且為發(fā)現(xiàn)新化合物提供可能。在本研究中,采用乙酸乙酯和正丁醇對海洋植物旋花濱(Calystegiasoldanella)浸提。首先用乙酸乙酯和石油醚將乙酸乙酯相浸膏用正相柱洗脫,然后用甲醇(甲醇和水)反相柱,從中得到含量最大的組分(化合物)。利用TLC判斷不同溶劑的配比。利用HPLC-MS、NMR和2D-NMR鑒別出新化合物。這些經(jīng)鑒定的化合物包括10個已知的化合物:(+)-Eudesmin(1)、Sesaminol(2)、Sesamin(3)、1,2-Benzenediol、3-methoxy-5-[(lRR,3aS,4R,6aS)-tetrahydro-4-(7-methoxy-1,3-benzodioxol-5-yl)-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl-(4)、Pinoresinol(5)、pluviatilol(6)、9-hydroxy-10,12,15-octadecatrienoicAcid Methyl Ester(7)、sesamin-2,2'-diol Compound(8)、Isoflucosteriol(9)、2'-Methoxy-4”-Hydroxymethoxykobusin(10)。同時對化合物10進(jìn)行了 2D-NMR分析。與化合物2’-methoxykobusin相比,化合物10缺少1個甲基,同時確定了羥基的位置。利用乙酸乙酯從蓬蘽(Rubushirutus thunb)中分離得到1種已知化合物(ergosterol)。從正丁醇相浸膏中分離得到 2 個已知化合物(3-phenylpropionic acid,(+)-5'-Methoxyisolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside)。由于海洋環(huán)境中仍有大量值得關(guān)注的化合物,它們?nèi)匀皇俏幢婚_發(fā)的藥物寶庫,并且在今后的一段時間里被開發(fā)利用為新穎藥物。由于海洋綠藻能夠產(chǎn)生大量的次級代謝產(chǎn)物,因此研究人員已經(jīng)把新的關(guān)注點(diǎn)放在了海洋綠藻上。許多新的生物技術(shù)和工藝不僅需要用在大規(guī)模獲取海洋植物和藻類的次級代謝產(chǎn)物,而且還可以用以發(fā)現(xiàn)新天然抗生素。適用于海洋生物的生物培養(yǎng)技術(shù)和分離純化方法,其經(jīng)驗方法主要來源于陸地生物,但也反映了海洋生物棲息地的具體需求。目前隨著代謝工程和海洋微生物技術(shù)的發(fā)展,已經(jīng)使其轉(zhuǎn)化為實(shí)驗中的一系列步驟,這也是改進(jìn)次級代謝產(chǎn)物生物合成過程和建立新方法的最佳選擇。本文從海洋植物和藻類的海洋抗生素生物合成技術(shù)工作中,指出生物技術(shù)在抗生素發(fā)現(xiàn)到開發(fā)各個階段的發(fā)揮巨大的潛力。同時,論文還揭示了海洋植物和海洋藻類抗生素以及其營養(yǎng)和藥物產(chǎn)品的可持續(xù)創(chuàng)新生產(chǎn),需要在生物技術(shù)和方法開發(fā)上投入更多。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914
【文章目錄】：
Acknowledgement
摘要
Abstract
List of Abbreviations
CHAPTER 1: Natural Products from Green algae Chlorophyta and Blue Algae Cyanobacteria A mini review
    1.1 Introduction
    1.2 Green algae, a source of bioactive secondary metabolites
    1.3 Alkaloids from green algae
        1.3.1 Bisindole alkaloids
        1.3.2 Other alkaloids and Prenylated compounds
    1.4 Terpenes from Green algae
        1.4.1 Sesquiterpenes
        1.4.2 Diterpenoids
    1.5 Steroids and fatty acid
    1.6 Glycerol and lipids
    1.7 Natural Products from Cyanobacteria
CHAPTER 2: Bioactive Natural Products from Green Algae
    2.1 Introduction
    2.2 Experimental technique
        2.2.1 Algae accumulation
            2.2.1.2 Extraction and isolation of green algae Cladophora stempsonii
            2.2.1.3 First step of extraction
            2.2.1.4 Second step of extraction
            2.2.1.5 Third step of extraction
    2.3 Results and discussion
        2.3.1 Identification and Structure Elucidation of green algae Compounds
            2.3.1.1 Structures determination
        2.3.2 Anti-bacterial activity of green algae compounds
CHAPTER 3: Antioxdant Activities of Compounds from Suaeda Endophytic Fungus and Calystegiasoldanella
    3.1 Equipment's materials
        3.1.1 Equipment
    3.2 Experimental Methods
        3.2.1 Plant Collection
        3.2.2 Extraction and isolation of Plant Calystegia soldanella
        3.2.3 First Step of Extraction
        3.2.4 Second Step of Extraction
        3.2.5 Third Step of Extraction
    3.3 Results and Discussion
        3.3.1 Identification and Structure Elucidation of Compounds
            3.3.1.1 Structures Determination
        3.3.2 Anti-oxidatant Assay
            3.3.2.1 DPPH Radical Scavenging Method
            3.3.2.2 Ferric Reducing Antioxidant Power （FRAP） Assay
        3.3.3 Antioxdant Activities of Compounds from Suaeda Endophytic Fungus
    3.4 Summary
CHAPTER 4: Isolation of Natural Products from Rubus Hirsutus Thunb
    4.1 Introduction
    4.2 Material and Method
        4.2.1 Plant Accumulation
        4.2.2 Extraction and Isolation Process of Plant Rubus Hirsutus Thunb
            4.2.2.1 Extraction with Ethyl-acetate
            4.2.2.2 Extraction with n-butanol
    4.3 Results and Discussion
        4.3.1 Elucidation of isolated compounds and their structure determination
            4.3.1.1 Structure determination
CHAPTER 5: Summary and Conclusion
References
Supplementary material
個人簡介

【參考文獻(xiàn)】

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1 程戰(zhàn)立;時巖鵬;種小桃;姚慶強(qiáng);;藏紫菀化學(xué)成分的研究(Ⅱ)[J];中草藥;2011年01期

2 徐劍錕;張?zhí)忑?易國卿;許穎;吳紅華;裴月湖;;半夏化學(xué)成分的分離與鑒定[J];沈陽藥科大學(xué)學(xué)報;2010年06期

本文編號：2890592