發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 04:53

　　 癌癥是目前世界范圍一大公共衛(wèi)生問題,一直以來嚴(yán)重威脅人類健康�；�療作為一種重要的癌癥治療手段,在臨床上失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。而腫瘤細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是癌癥化療失敗主要原因之一。ABCB1和ABCG2蛋白作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的成員,在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的過程中起著重要作用。基于兩者在腫瘤細(xì)胞中分布的廣泛性以及作用機(jī)理的明確性,ABCB1及ABCG2一直以來都是臨床前研究及臨床治療的重要靶點(diǎn)。前期工作中我們通過MTT法對(duì)17種新合成化合物的逆轉(zhuǎn)耐藥活性進(jìn)行了初步檢測(cè)。最終篩選出活性較好的LS-2-3j作為研究對(duì)象。LS-2-3j(10-oxo-5-(3-(pyrrolidin-1-yl)propyl)-5,10-dihydroindeno[1,2-b]indol-9-yl propionate)是一種新型合成的吲哚類衍生物,本論文對(duì)其逆轉(zhuǎn)耐藥作用及機(jī)制展開了研究工作。我們利用細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建了 ABCG2過表達(dá)的多藥耐藥細(xì)胞株MCF-7/ABCG2 及293T/ABCG2,并通過 Western Blot檢測(cè)了細(xì)胞株內(nèi) ABCG2的表達(dá)水平。其次,采用MTT法檢測(cè)化合物L(fēng)S-2-3j對(duì)ABCB1或ABCG2過表達(dá)多藥耐藥細(xì)胞、化療藥物敏感細(xì)胞以及正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明LS-2-3j對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性小于腫瘤細(xì)胞。然后,我們選出LS-2-3j對(duì)上述細(xì)胞株的細(xì)胞存活率大于80%的化合物濃度(0.25 μmol/L、0.5μmol/L和1 μmol/L),采用MTT法檢測(cè)LS-2-3j在不同濃度下對(duì)多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)。結(jié)果表明,LS-2-3j能夠顯著提高ABCB1或ABCG2過表達(dá)多藥耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。進(jìn)一步,我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了DOX和MITX在ABCB1過表達(dá)細(xì)胞K562/A02和ABCG2過表達(dá)細(xì)胞MCF-7/ABCG2中的累積和外排水平。結(jié)果顯示,經(jīng)LS-2-3j預(yù)處理后,DOX和MITX在K562/A02和MCF-7/ABCG2細(xì)胞中的累積量顯著提高;同時(shí),LS-2-3j能夠顯著抑制K562/A02及MCF-7/ABCG2細(xì)胞中DOX及MITX的外排。然而,LS-2-3j對(duì)親本細(xì)胞K562及MCF-7并沒有明顯的促DOX和MITX累積和外排作用。然后,我們檢測(cè)了LS-2-3j對(duì)ABCB 1及ABCG2蛋白ATP酶活性的抑制情況,發(fā)現(xiàn)LS-2-3j能夠抑制兩種蛋白ATP酶的活性。采用Western Blot及real-time PCR技術(shù),我們也發(fā)現(xiàn),LS-2-3j能夠顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ABCB1及ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。綜上所述,LS-2-3j作為一種合成的新結(jié)構(gòu)吲哚類化合物,具有很強(qiáng)的體外逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。其機(jī)制是能夠靶向和抑制ABCB1和ABCG2兩種多藥耐藥泵的功能和表達(dá)。一方面,LS-2-3j能夠抑制ABCB1和ABCG2蛋白ATP酶的活性,從而增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物的累積而增強(qiáng)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。另一方面,LS-2-3j能夠顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ABCB1及ABCG2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。因此,LS-2-3j作為ABCB1和ABCG2的抑制劑具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的效果。所以本論文為臨床抗多藥耐藥的治療提供了理論和體外的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),而LS-2-3j作為先導(dǎo)化合物,為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的藥物研發(fā)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖２．２?ＡＢＣＧ２蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２、２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２及其親??本細(xì)胞中的表達(dá)水平。灰度分析結(jié)果以相對(duì)２９３Ｔ及ＭＣＦ－７對(duì)照組的倍數(shù)方式呈??現(xiàn)，ＧＡＰＤＨ為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)三次取平均值（ｍｅａｎ?士?ＳＤ）〇??Ｐ值與２９３Ｔ或ＭＣＦ－７對(duì)照組比較所得，其中＞＜０．０５廣ｐ＜０．０１廣＞＜０．００１。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡＢＣＧ２?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｔａｂｌｙ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２?ａｎｄ??２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ｐａｒｅｎｔａｌ?ｃｅｌｌｓ．?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ａｒｅ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ?ｔｏ??ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ｏｆ?２９３Ｔ?ｏｒ?ＭＣＦ－７．?ＧＡＰＤＨ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｎａｌ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?ｔｈｅ??ｆｉｇｕｒｅ．?Ｅａｃｈ?ｂａｒ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｔｈｅ?ｍｅａｎ?±?ＳＤ?ｏｆ?ｔｈｒｅｅ?ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，?ｐ?＜??０．０５，?ｐ?＜?０．０１，?ｐ?＜?０．００１?ｖｓ．?ｔｈｅ?２９３Ｔ?ｏｒ?ＭＣＦ－７?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ．??２．?３．?２抗腫瘤多藥耐藥化合物的篩選??ＭＴＴ檢測(cè)法是一種檢測(cè)細(xì)胞增值或細(xì)胞存活的實(shí)驗(yàn)方法�；�合物ＭＴＴ可以??

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文??２．?３．?３?ＬＳ－２－３?ｊ的細(xì)胞毒性分析??本研宄采用ＭＴＴ法進(jìn)一步檢測(cè)了化合物ＬＳ－２－３ｊ對(duì)多藥耐藥細(xì)胞，化療藥??物敏感細(xì)胞及正常細(xì)胞的生長抑制率，進(jìn)而得出ＬＳ－２－３ｊ對(duì)不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性。??如圖?２．３?所示，化合物?ＬＳ－２－３ｊ?對(duì)?ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７／Ａｄｒ、ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２、Ｋ５６２、??Ｋ５６２／Ａ０２、ＫＢ、ＫＢ／ＶＣＲ、２９３Ｔ、２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２、ＢＥＡＳ／２Ｂ?和?Ｌ０２?等細(xì)胞的?ＩＣ５０??ｆ＾ｃ＾＾；３．１８８±０．１５３?ｎｍｏｌ／Ｌ，２．４３４±０．２０８?（ｊｍｏｌ／Ｌ＾４．０１９±０．１８９?＾ｍｏｌ／Ｌ，４．５８０±０．８８０??ｊｉｍｏｌ／Ｌ、４．８１４士０．４９４?ｐｍｏｌ／Ｌ、４．０５３±０．６８０?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、２．７５８士０．２３０?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、??７．３５５±０．３５７?｜＿ｕｎｏｌ／Ｌ、６．８００±０．７２３?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、１０．８３５±０．２１５?ｐｍｏｌ／Ｌ、１２．１８３±０．２２４??Ｕｍｏｌ／Ｌ。如上所示，ＬＳ－２－３ｊ對(duì)正常細(xì)胞２９３Ｔ、ＢＥＡＳ／２Ｂ和Ｌ０２的細(xì)胞毒性要??低于腫瘤細(xì)胞，而對(duì)多藥耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞的細(xì)胞毒性相當(dāng)。??

從３．３．１實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得知，ＬＳ－２－３ｊ能夠明顯提高抗癌藥物在ＡＢＣＢ１和??ＡＢＣＧ２過表達(dá)耐藥細(xì)胞內(nèi)的積累量，因此本實(shí)驗(yàn)中，我們探討了?ＬＳ－２－３Ｊ對(duì)化??療藥物外排的影響。如圖３．２Ａ和Ｃ所示，在ＡＢＣＢ１過表達(dá)的多藥耐藥細(xì)胞??Ｋ５６２／Ａ０２中，ＤＯＸ在細(xì)胞內(nèi)的累積量由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到６２．３２９％?（１２０?ｍｉｎ）；??經(jīng)ＬＳ－２－３ｊ預(yù)處理之后，累積量由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到７５．１２１％?（１２０?ｍｉｎ），ＤＯＸ??的流出量明顯減少。而在化療藥物敏感型親本細(xì)胞Ｋ５６２中，ＤＯＸ在細(xì)胞內(nèi)的??累積量僅由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到８５．０７３％?（１２０?ｍｉｎ），其在細(xì)胞內(nèi)的累積量高于??耐藥細(xì)胞。同樣如圖３．２Ｂ和Ｄ所示，在ＡＢＣＧ２過表達(dá)的ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２細(xì)胞??中，ＭＩＴＸ?在細(xì)胞內(nèi)由?１００％?（０?ｍｉｎ）降低到?６１．３１４％?（１２０?ｍｉｎ）；經(jīng)?ＬＳ－２－３ｊ?預(yù)處??理之后，ＭＩＴＸ的流出明顯減少，細(xì)胞內(nèi)積累量僅由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到７０．２３９％??（１２０ｍｉｎ）。所以綜上所述
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本文編號(hào)：2885642