發(fā)布時間：2020-11-12 22:20

　　 背景本文以臨床治療非小細胞肺癌的多西他賽注射液(DTX-IN)缺乏肺靶向性、DTX用藥量較大以及注射液中增溶劑聚山梨酯80容易引起過敏等毒副反應為切入點,采用自主創(chuàng)建的固體分散和水化泡騰技術,設計并制備的新型多西他賽脂質體(DTX-LP),不僅極大降低了聚山梨酯80的使用量,而且具有高度肺靶向性、能將約90%的DTX傳遞至肺部及其腫瘤組織,從而提高抗肺癌效果且降低毒副作用。目的本文基于兔VX2原位肺癌模型,從抗肺癌藥效學實驗、藥物組織分布、藥代動力學行為、藥物體內(nèi)代謝等方面,考察設計制備的DTX-LP是否達到了提高療效而降低毒副作用的目的。方法1.兔VX2原位肺癌模型的建立。采用微創(chuàng)胸腔穿刺術制作兔VX2原位肺癌模型(以下簡稱模型兔),以CT、大體解剖和HE染色等方法,確證模型是否建立成功,計算模型接種成功率,觀察其生存狀態(tài)以及肺癌的生長情況。2.基于兔VX2原位肺癌模型進行DTX-LP抗肺癌藥效學實驗。將模型兔隨機分為對照組、DTX-IN組、DTX-LP低劑量組和DTX-LP高劑量組,分別給予生理鹽水、DTX-IN(1.0 mg/kg)、DTX-LP(0.5 mg/kg)、DTX-LP(1.0 mg/kg),每周一次,連續(xù)六周。以抑瘤率、凋亡率、增殖率、微血管生成情況、生存期、HE病理切片和自身體重變化等為指標,考察DTX-LP在兔VX2原位肺癌模型上的抗肺癌藥效。3.基于兔VX2原位肺癌模型進行DTX-LP的組織分布和藥代動力學研究。將模型兔隨機分為DTX-IN組和DTX-LP組,分別給予同等劑量(1.0 mg/kg)的DTX-IN和DTX-LP。采用HPLC-UV方法,測定給藥后0.5h、1.5h、4h、8h和24h等時間點的心、肝、脾、肺、腎、胃、腦和腫瘤等組織中DTX的分布情況;采用UPLC-MS/MS方法,測定給藥后5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、4h和8h等時間點的血漿藥物濃度,計算其藥代動力學參數(shù)。4.基于兔VX2原位肺癌模型進行DTX-LP體內(nèi)代謝研究。將模型兔隨機分為DTX-IN組和DTX-LP組,分別給予同等劑量(2.0 mg/kg)的DTX-IN和DTX-LP。收集各組的肺組織、肝組織、膽汁以及糞便。采用UPLC-MS/MS方法,測定DTX及其代謝物。結果1.成功建立了兔VX2原位肺癌模型。采用微創(chuàng)胸腔穿刺術成功實現(xiàn)了快速、批量制作兔VX2原位肺癌模型。該方法具有接種快(一例約15min)、成功率高(100%)以及接種部位準確(右肺中部)等優(yōu)點。接種兩周后,CT觀察到右肺中部有直徑2-10mm結節(jié);組織HE染色顯示腫瘤結節(jié)細胞浸潤生長,腫瘤細胞異型性明顯。模型兔平均生存周期為42.0±10.8天,腫瘤倍增時間為5.19±0.81天。2.成功進行了基于兔VX2原位肺癌模型的DTX-LP抗肺癌藥效學實驗。與同等劑量(1.0 mg/kg)的DTX-IN比較,DTX-LP制劑具有顯著提高療效、降低毒副作用以及延長生存時間近一倍等優(yōu)點。經(jīng)6周治療實驗顯示:(1)同等劑量下的DTX-IN和DTX-LP組CT抑瘤率分別為84.39%和94.71%(P0.01),這表明DTX-LP提高療效顯著;(2)在對照組、DTX-IN組、DTX-LP低劑量組和DTX-LP高劑量組中,采用FCM測得的凋亡率分別為29.64%±3.80%、43.23%±2.13%、44.15%±4.76%和68.75%±5.90%(其中DTX-IN組和DTX-LP高劑量組之間P0.01),采用TUNEL測得凋亡指數(shù)分別為7.9%±1.0%、11.7%±1.1%、11.6%±0.7%、13.9%±0.9%(其中DTX-IN組和DTX-LP高劑量組之間p0.01),PCNA測得增殖指數(shù)分別為41.7%±8.2%、21.1%±3.4%、23.1%±2.1%、15.6%±2.7%(其中DTX-IN組和DTX-LP高劑量組之間P0.05),這些測定數(shù)據(jù)都表明DTX-LP高劑量組能顯著增加腫瘤組織的凋亡;(3)免疫組織化學CD31實驗證實,DTX-LP高劑量組明顯減少腫瘤新生血管生成;(4)大體解剖實驗顯示,DTX-LP高劑量組能減少腫瘤肺部擴散和胸腔轉移;(5)各組織的病理切片結果顯示,DTX-IN對模型兔非靶組織(如心、肝、脾、腎等)有較為明顯的病理改變,而同等劑量的DTX-LP則無明顯改變,這表明DTX-LP基本對心、肝、脾和腎等非靶組織基本無毒副作用;(6)在對照組、DTX-IN組、DTX-LP低劑量組和DTX-LP高劑量組中,自身體重的平均下降率分別為32.6%、25.2%、17.9%和15.6%,這表明DTX-LP組對自身體重下降情況有明顯改善;而平均生存的時間(天)分別為41.0±11.1、56.0±11.9、60.5±14.0和92.3±21.8(其中DTX-IN組和DTX-LP高劑量組之間P0.05),這表明DTX-LP高劑量組可延長生存時間近一倍。3.成功進行了基于兔VX2原位肺癌模型的組織分布和藥代動力學研究。經(jīng)實驗顯示,給予DTX-LP后30min、1.5h、4h、8h和12h等不同時間點肺部的DTX濃度(μg/g)分別為76.97±3.99、50.45±5.46、39.87±3.89、39.42±8.52和28.03±4.10;腫瘤組織中DTX的濃度(μg/g)分別為57.31±9.30、48.48±4.21、33.80±2.23、32.05±2.37和28.93±2.01,這些數(shù)據(jù)都相應明顯高于DTX-IN組,如1.5h兔肺部和腫瘤組織中DTX的濃度是DTX-IN的10.2倍和5.8倍;非靶組織(如肝、脾、腎等)中DTX的濃度明顯降低,提示DTX在這些組織基本無毒副作用,這與病理切片結果一致;而給予DTX-LP后各時間點的血藥濃度都相應低于DTX-IN組,血漿C_(max)、t_(1/2)、AUC_(0→t)分別為DTX-IN組的0.86倍、0.44倍和0.37倍(P0.05)。這就表明DTX-LP進入體內(nèi)后快速由血液分布到肺部及其肺癌組織中。4.成功進行了基于兔VX2原位肺癌模型的體內(nèi)代謝研究。經(jīng)模型兔實驗發(fā)現(xiàn),在DTX-IN組和DTX-LP組中糞便的代謝物基本一致,都含有原藥DTX(M)及其已知代謝產(chǎn)物四種(即M-1/3、M-2和M-4)。另外,從MS的離子豐度顯示,DTX-IN組中代謝物的濃度在8-24h時間段達到峰濃度,而DTX-LP組中代謝物的濃度則在24-48h時間段達到峰濃度。這就提示,DTX被包裹成脂質體后,DTX代謝途徑并未改變,只是延遲了DTX的代謝轉化時間。結論綜上所述,本文成功進行了基于兔VX2原位肺癌模型的DTX-LP藥效學研究。與DTX-IN相比,設計制備的DTX-LP未改變DTX代謝途徑而只是延遲了DTX的代謝轉化時間,并且具有顯著提高療效、降低毒副作用以及延長生存時間近一倍等優(yōu)點。為此,可以認為設計制備的DTX-LP達到了提高療效而降低毒副作用的目的。這就意味著具有高效低毒的DTX-LP是一種非常具有臨床應用前景的靶向制劑。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

17圖 1-1 透視條件下的胸腔微創(chuàng)穿刺術建立兔 VX2 原位肺癌模型過程A.固定、消毒、鋪巾；B.穿刺針體外透視定位；C.穿刺針刺入兔右肺；D.穿刺針體內(nèi)透視定位；E.拔出穿刺針，手術結束；F.兔蘇醒Fig.1-1 The procedure of minimal invasive percutaneous puncture inoculation to establishVX2 orthotopic lung cancer rabbits model (A) fixed on the digital gastrointestinal machine; (Bposition in vitro; (C) percutaneous puncture inoculation; (D)position in vivo; (E) withdrawingthe needle; (F) wake up after inoculation

21圖 1-3 模型兔肺部大體解剖觀察（黑色箭頭表示腫瘤結節(jié)）種后 3 周后肺組織；B. 接種后 6 周后肺組織；C.自然死亡后肺組織；D. 自然死亡腫瘤胸壁、氣管、胸膜等多處轉移1-3 the probable tumors confirmed by necropsy (the black or white arrows indicatedntrapulmonary tumors) A.Lungs at 3 weeks post inoculation; B.Lungs at 6 weeks poinoculation; C.Lungs after nature death; D. pleural metastases圖 1-3 顯示，接種第 3 周時，肉眼觀察到模型兔右肺 VX2 移植瘤結節(jié)為呈現(xiàn)右肺單一生長，邊緣清晰，無包膜，質地較硬，切面呈實質性，灰樣；接種 6 周后，腫瘤結節(jié)不僅體積增大，而且出現(xiàn)肺單側轉移，散在轉移瘤，呈現(xiàn)彌漫生長狀態(tài)，部分融合成片狀，表面呈魚肉樣。隨后腫一步擴散，高度浸潤性生長，并呈現(xiàn)雙肺、胸壁、氣管和支氣管、胸膜

23圖 1-4 VX2 腫瘤結節(jié)組織病理學檢查（HE 染色）A.接種 3 周（200×）；B.接種 3 周（400×）；C.接種 6 周（200×）；D.接種 6 周（400×）；E.自然死亡后（200×）；F. 自然死亡后（400×）Fig.1-4 The histological view of VX2 lung tumor (HE staining)A.three weeks post-incubation (200×); B.three weeks post-incubation (400×); C.six weekspost-incubation (200×); D.six weeks post-incubation (400×); E.after nature death (200×);F.after nature death (400×)圖 1-4 顯示，HE 染色切片顯示腫瘤結節(jié)細胞為低分化鱗癌，低倍鏡下，腫瘤細胞緊密呈實體巢狀，大小不等，且癌巢向周圍組織浸潤生長，高倍鏡下腫瘤細
【參考文獻】

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本文編號：2881309