發(fā)布時間：2020-11-12 11:27

　　 隨著社會的發(fā)展、環(huán)境的變化以及老齡化程度的增加,腦部疾病如癲癇、阿爾茨海默病、抑郁癥、帕金森癥、腦缺血等的發(fā)病率逐年增高。同時,由于腦組織內(nèi)藥物濃度太低或藥物難以到達(dá)病灶等問題的存在,嚴(yán)重影響了腦部疾病的治療,威脅著人類的健康。尤其是血腦屏障的生理作用使得藥物靶向大腦治療腦部疾病一直存在問題。為了提高血腦屏障的滲透性,增加藥物的腦內(nèi)分布,人類想出各種方法如:通過化學(xué)修飾制備成親脂性前藥、使用血管活化物質(zhì)、制備納米遞藥系統(tǒng)和繞過血腦屏障途徑給藥等。雖然進(jìn)入腦內(nèi)的藥物量提高了,但藥物又面臨被快速清除出腦和腦內(nèi)滯留時間短的問題。傳統(tǒng)理論認(rèn)為藥物外排出腦的途徑之一是通過蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的腦脊液攜帶藥物,經(jīng)靜脈竇的蛛網(wǎng)膜顆粒吸收入血從而排出腦部。然而近年來與頸深淋巴結(jié)相通的硬腦膜淋巴管的發(fā)現(xiàn),為探究藥物的腦部外排途徑提供了新思路。本研究通過制備載香豆素-6 mPEG-PLA膠束,對其理化性質(zhì)、體外釋放行為、細(xì)胞毒性和經(jīng)鼻給藥后的腦內(nèi)分布,以及mPEG-PLA膠束對體內(nèi)細(xì)胞因子變化影響進(jìn)行了全面的研究。本研究選用mPEG-PLA聚合物作為載體材料。該類聚合物親水段由一定長度的聚乙二醇組成,可提高膠束的體內(nèi)滯留時間。我們采用薄膜水化法制備載香豆素-6熒光標(biāo)記膠束,并通過透射電鏡和激光粒度儀分別對膠束的形態(tài)和粒徑大小進(jìn)行表征。結(jié)果測得膠束呈規(guī)則球形,外觀圓整;激光粒度儀顯示膠束平均粒徑為(31.22±1.07)nm,PDI為0.178,粒徑分散性良好,且與空白膠束(30.49±0.78)nm無統(tǒng)計學(xué)差異。通過高效液相色譜儀測得載香豆素-6膠束的平均包封率和載藥量分別為80.18%和1.30%。體外泄漏實驗結(jié)果得出,香豆素-6在37℃,pH 7.4的PBS溶液中,24 h內(nèi)的泄漏程度較低(4%)。這表明香豆素-6不易從膠束中泄漏,可較準(zhǔn)確地示蹤膠束在體內(nèi)的行為,為膠束進(jìn)入體內(nèi)的實驗奠定了基礎(chǔ)。本研究利用MTT法測定載香豆素-6膠束與空白mPEG-PLA膠束對Calu-3細(xì)胞的體外毒性,對其經(jīng)鼻給藥的安全性進(jìn)行考察。當(dāng)膠束濃度小于4 mg·mL~(-1)時,兩者孵育3h,細(xì)胞存活率為80%-100%,表明無細(xì)胞毒性。當(dāng)膠束濃度達(dá)到8 mg·mL~(-1),載藥膠束的細(xì)胞存活率在50%-80%,而空白膠束存活率仍高于80%。這說明載藥膠束濃度升高會對細(xì)胞產(chǎn)生低毒性。此外,我們還觀察了膠束的腦內(nèi)分布,通過鼻腔滴注載香豆素-6膠束,在給藥30 min后取腦組織進(jìn)行冷凍切片,并于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦皮層、紋狀體圖和海馬區(qū)域均有綠色熒光分布,說明膠束經(jīng)鼻給藥后能夠抵達(dá)腦實質(zhì)。本研究制備了LTG載藥膠束,并初步探究了膠束經(jīng)鼻給藥入腦后對細(xì)胞因子(IL-6)的影響。LTG mPEG-PLA膠束平均粒徑為(33.1±3.0)nm,與載香豆素-6膠束、空白膠束粒徑均無顯著性差異。將拉莫三嗪膠束與生理鹽水分別對大鼠進(jìn)行鼻腔給藥,在30 min和90min兩個時間點取大鼠頸深淋巴結(jié)、腦組織、頸靜脈血和腦脊液,用ELISA法測定各樣品的IL-6水平。由結(jié)果得大鼠鼻腔給予LTG膠束30 min后,腦脊液與頸靜脈血中IL-6水平基本無明顯變化,均處于正常水平。腦組織和頸深淋巴結(jié)中的IL-6含量明顯升高(P0.05),分別為生理鹽水對照組的2.06倍與1.62倍。但給藥90 min后,IL-6的含量又降低至與生理鹽水對照組無明顯差異的水平。表明LTG膠束經(jīng)鼻入腦后,有可能激活免疫應(yīng)答反應(yīng)并促進(jìn)相關(guān)免疫細(xì)胞合成和釋放IL-6。90 min后,隨著膠束被清除出腦,腦組織中的IL-6水平也相應(yīng)降低。本研究通過21天的mPEG-PLA膠束長期鼻腔給藥實驗,更全面地探究了鼻腔給藥對各組織中相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響。在第21天給藥后的30 min取血漿、腦脊液、頸深淋巴結(jié)與腦組織勻漿液,用Luminex液態(tài)芯片技術(shù)同時測定大鼠相關(guān)細(xì)胞因子水平(IFN-γ、IL-10、IL-13、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α)。結(jié)果表明,與生理鹽水組相比,血漿中各因子水平無明顯變化;腦脊液中IL-6和頸深淋巴結(jié)中前炎因子IL-1β與TNF-α水平有所上升;同時腦組織中的抗炎因子IL-10也有所上調(diào)。這說明膠束經(jīng)鼻進(jìn)腦后可能引起機體免疫應(yīng)答并釋放出前炎因子,介導(dǎo)相關(guān)免疫細(xì)胞增殖吞噬膠束,從而促進(jìn)膠束經(jīng)硬腦膜淋巴管外排進(jìn)入頸深淋巴結(jié)。同時,隨著前炎因子的產(chǎn)生,機體也通過負(fù)反饋途徑釋放抗炎因子以維持機體的穩(wěn)定�？傊�,本研究為開發(fā)新型藥物劑型和給藥方式以減少腦內(nèi)微粒淋巴外排,延長藥物作用時間和提高生物利用度提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R96
【部分圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文異性結(jié)合，實現(xiàn)對同一樣品中不同分子的快速定性和定量檢測懸浮液中進(jìn)行的，且檢測速度較快，因此也稱為懸浮陣列[44]。料為聚苯乙烯，，通過改變熒光染料在兩種不同熒光光譜中的不同陣列組成的 100 個特定光譜的微球，每個微球都能與不同又可與 100 種不同的分析物結(jié)合，然后用高速數(shù)字信號處理器或 CCD 相機基于流動的陣列讀取器基于獨特的熒光珠標(biāo)記識量化與該微球相關(guān)的報告物的熒光強度[45]，從而實現(xiàn)單個反應(yīng)分子。該技術(shù)為高通量分子檢測提供了新平臺，并且正在越來9]。

12圖 2-1 膠束透射電鏡圖（a 香豆素-6 膠束；b 空白膠束）Fig.2-1 The morphology of micelles by TEM(a coumarin-6 micelles; b blank midelles)

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.3.2.1 香豆素-6 的紫外吸收圖譜香豆素-6 甲醇溶液、mPEG-PLA 甲醇溶液在波長范圍為 200-800 nm 進(jìn)行描，結(jié)果如圖 2-3，香豆素 6 的最大吸收波長為 465 nm，且此波長下 mPEG-PL材料無吸收干擾，因此其 HPLC 檢測波長確定為 465 nm。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2880694