發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 08:28

　　 抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌和真菌耐藥性成為不可忽視的問題�？咕�肽由于其獨(dú)特作用機(jī)制,細(xì)菌和真菌不易對其產(chǎn)生耐藥性,具有開發(fā)成新型抗生素的潛力。但是天然抗菌肽往往存在活性不高、提取過程復(fù)雜等不足,限制了抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用。人工設(shè)計(jì)多肽是獲取新型抗菌肽的一種有效途徑。本研究從實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的抗菌肽庫設(shè)計(jì)軟件V1.0設(shè)計(jì)獲得的肽庫中隨機(jī)挑選100條多肽序列,進(jìn)行固相合成。通過抑菌實(shí)驗(yàn)測試了100條多肽的抗菌活性,從中篩選出一條廣譜高抑菌活性的抗菌肽,將其命名為SAMP1。對抗菌肽SAMP1進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,篩選到更加高效低毒的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4對熱帶念珠菌的最小抑菌濃度均為3.9μg·mL~(-1),對單增李斯特菌的最小抑菌濃度分別是3.9μg·mL~(-1)和0.95μg·mL~(-1)。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)SAMP1-A3和SAMP1-A4濃度為62.5μg·mL~(-1)時(shí),引起溶血率分別為0%和2.7%。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)SAMP1-A3和SAMP1-A4在40×MIC濃度下處理24h后,并未造成HUVEC細(xì)胞死亡。濃度在125μg·mL~(-1)以下時(shí),SKOV3細(xì)胞生長不受影響,說明抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4對哺乳動物細(xì)胞沒有毒性。因此,SAMP1-A3和SAMP1-A4是抗菌活性強(qiáng)、生物安全性高的抗菌肽。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:SAMP1-A3和SAMP1-A4在80℃下加熱30min抑菌活性不變,在pH2.0~8.0范圍內(nèi)處理1h后活性不變,25%血漿處理6h后抑菌活性不變,但對胰蛋白酶敏感。圓二色譜結(jié)果顯示,在50%體積分?jǐn)?shù)的TFE溶液中,SAMP1-A3和SAMP1-A4的α-螺旋比例增加。利用掃描電鏡、透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)研究抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4引起熱帶念珠菌和單增李斯特菌細(xì)胞膜破裂,內(nèi)容物泄露致使病原菌死亡;抗菌肽SAMP1-A4可以破壞單增李斯特菌細(xì)胞器結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜形成損傷。綜上所述,本研究獲得了到兩條高效低毒且具有較高穩(wěn)定性的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4,并證明其通過破壞病原菌細(xì)胞膜完整性而發(fā)揮抗菌作用。
【學(xué)位單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

第三章 結(jié)果與分析×MIC（3.9μg·mL-1）濃度的 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 的 SD 培養(yǎng)基中，測試線。結(jié)果如圖 3-1 所示，在 1×MIC 濃度下，兩種抗菌肽發(fā)揮抗菌作用過程具賴性，在作用 1 h 后抗菌速率提升，在 4 h 內(nèi)使熱帶念珠菌完全死亡，所以兩對熱帶念珠菌都具有殺菌作用。

圖 3-2 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 處理后單增李斯特菌生長曲線ig.3-2 Growth curve of L.monocytogenes post-treatment of SAMP1-A3 and SAMP1-AAMP1 及其類似肽的溶血毒性了評估肽對哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞毒性，在不同肽濃度下測定了對人類紅細(xì)胞分比（表 3-3）。結(jié)果顯示，經(jīng)過序列重排后正電荷氨基酸殘基聚集在 C 端的AMP1-A1 和正電荷氨基酸殘基均勻分布的類似肽 SAMP1-A2 溶血毒性升高荷氨基酸殘基聚集在 N 端的類似肽 SAMP1-A3 溶血毒性降低。用 Arg 替換類似肽 SAMP1-A4 與抗菌肽 SAMP1 相比溶血毒性降低。用 Val 作為疏水性基的類似肽 SAMP1-A7 溶血性降低，而用 Trp 作為疏水性氨基酸殘基的序-A8 顯示出溶血毒性增加，表明序列中加入色氨酸殘基可能會引起人紅細(xì)胞

圖 3-3 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 處理后 HUVEC 細(xì)胞形態(tài)Fig. 3-3 HUVEC cell morphology after treatment with SAMP1-A3 and SAMP1-A4.6.2 對 SKOV3 卵巢癌細(xì)胞的毒性目前已見報(bào)道的抗菌肽，不僅具有廣譜抑菌活性，還對癌細(xì)胞具有殺滅作用，具開發(fā)成新型抗癌藥物的巨大潛力。使用 MTT 法測定不同濃度的抗菌肽 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 對 SKOV3 卵巢癌胞的生長抑制情況，評估兩種抗菌肽的抗癌作用。結(jié)果如圖 3-4 所示，SAMP1-A3 SAMP1-A4 對 SKOV3 卵巢癌細(xì)胞殺傷作用并不明顯，當(dāng)多肽濃度高達(dá) 3000μg·mL-1，SKOV3 卵巢癌細(xì)胞存活率仍為 67%和 75.6%。當(dāng)多肽濃度在 125μg·mL-1以下時(shí)，細(xì)胞生長完全不受影響。由此可見，雖然 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 對真菌和細(xì)菌有高效抑菌活性，但對癌細(xì)胞的生長抑制作用并不大。
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本文編號：2880518