發(fā)布時間：2020-11-10 15:02

　　 蛋白降解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是一種雙功能雜合化合物,一邊用來結(jié)合靶蛋白,另一邊用來結(jié)合E3連接酶,使得目標(biāo)蛋白可以與E3連接酶結(jié)合,促進(jìn)靶蛋白泛素化并被蛋白酶體降解。實驗結(jié)果表明:與傳統(tǒng)蛋白抑制劑相比較,PROTAC在治療學(xué)的發(fā)展中具有廣闊的前景。最新研究證明沙利度胺及其衍生物可以結(jié)合到CRBN蛋白上,CRBN能與損傷DNA結(jié)合蛋白1(damaged DNA binding protein 1,DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)、Cullins1調(diào)控子(Roc1)結(jié)合起來,形成E3泛素連接酶復(fù)合物CRL4。該復(fù)合物可利用泛素化來標(biāo)記特定蛋白,隨后水解靶向蛋白。BI2536為PLK1(IC_(50):0.83 nM)和BRD4(IC_(50):25 nM)雙靶點(diǎn)蛋白酶抑制劑,并且其構(gòu)效關(guān)系研究證明其酰胺鍵連接部位為可改造部位。因此本論文以BI2536及其衍生物作為靶蛋白配體,可與PLK1、BRD4結(jié)合,沙利度胺類似物作為E3連接酶配體,可與E3連接酶進(jìn)行結(jié)合,選用不同長度和類型的連接體將兩者進(jìn)行連接,設(shè)計合成PROTAC BP系列化合物。并通過對化合物PLK1和BRD4蛋白抑制活性,人肺癌細(xì)胞A549和人髓性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞MV4-11細(xì)胞增殖抑制活性考察,并篩選出化合物BP-3以及對其MV4-11細(xì)胞凋亡的影響,對MV4-11胞中BRD4和PLK1蛋白降解能力和C-Myc蛋白表達(dá)進(jìn)行了考察,對化合物BP-3抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究。同時對其在大鼠中的藥代動力學(xué)特征進(jìn)行了研究。用ELISA方法驗證化合物對PLK1和BRD4蛋白抑制活性,實驗結(jié)果表明合成的PROTAC BP系列化合物都呈現(xiàn)很好的BRD4和PLK1蛋白抑制活性。構(gòu)效關(guān)系表明當(dāng)化合物R結(jié)構(gòu)為芐溴基,BI2536衍生物與沙利度胺類似物連接體為PEG且n=3時,對BRD4和PLK1蛋白抑制活性(BRD4:IC_(50)=12.3 nM;PLK1:IC_(50)=8.9 nM)最強(qiáng),當(dāng)連接體長度增加或替換為烷基鏈時對BRD4和PLK1蛋白抑制活性下降。CCK8法進(jìn)行細(xì)胞實驗結(jié)果表明,合成的PROTAC BP系列化合物都呈現(xiàn)很好的對人肺癌細(xì)胞A549和人髓性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞MV4-11細(xì)胞增殖抑制活性。其中化合物BP-2,BP-3和BP-4細(xì)胞增殖抑制活性都要優(yōu)于對照化合物BI2536。其中化合物BP-3對A549(IC_(50)=10.8 nM)和MV4-11(IC_(50)=7.6 nM)增殖抑制活性最強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測BI2536和化合物BP-3作用MV4-11 24 h后細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明,0、50、100 nM,化合物BP-3誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡率分別為6.2%、26.3%、33.3%。證明化合物BP-3可誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡,且促M(fèi)V4-11細(xì)胞凋亡活性要明顯優(yōu)于對照品BI2536。對MV4-11細(xì)胞周期影響研究顯示,化合物BP-3使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,BI2536細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。MV4-11細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測證明,化合物BP-3誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡可能通過PARP裂解,caspase-3活化和Bcl-2下調(diào)有關(guān)。Western-blot實驗結(jié)果表明化合物BP-3在20-30 nM濃度可以將BRD4蛋白完全降解;在40-50 nM濃度將PLK1蛋白降解,并且可降低BRD4下游通路中C-Myc蛋白的表達(dá),在40-50 nM濃度C-Myc蛋白表達(dá)消失。證明化合物BP-3具有BRD4和PLK1蛋白降解能力,并且因降解BRD4蛋白使下游通道C-Myc蛋白表達(dá)減少并消失,并且其蛋白降解能力呈劑量依賴關(guān)系�；�合物BP-3在50 nM濃度下與MV4-11細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h就可引起B(yǎng)RD4和PLK1明顯降解。證明化合物BP-3對MV4-11細(xì)胞中BRD4和PLK1蛋白具有強(qiáng)效、快速的降解能力。MV4-11細(xì)胞移植SCID小鼠體內(nèi)實驗證明,化合物BP-3,BI2536都能明顯抑制腫瘤的增長,但相同劑量下化合物BP-3抑制效果要優(yōu)于BI2536。同時腫瘤組織BRD4,PLK1和C-Myc蛋白表達(dá)顯示,化合物BP-3可通過使PLK1和BRD4蛋白降解,并降低C-Myc蛋白表達(dá)來達(dá)到抑制腫瘤生長作用。同時本論文對化合物BP-3大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究,建立了應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測定化合物BP-3血藥濃度的方法,結(jié)果表明,該方法專屬性高,精密度、準(zhǔn)確度良好,血漿樣品處理采用沉淀法,操作簡單,能夠滿足化合物BP-3的藥代動力學(xué)研究。通過體外體內(nèi)生物活性實驗證明,本論文設(shè)計合成的化合物BP-3可快速、有效的降解BRD4和PLK1蛋白,并使C-Myc蛋白表達(dá)降低,同時具有很好的腫瘤生長抑制能力。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

TX2-121-1 TX2-135-2 TX2-120-1圖 2 疏水標(biāo)記（HyT）技術(shù)開發(fā)的化合物結(jié)構(gòu)1.2.3 蛋白降解靶向嵌合體技術(shù)PROTACs 是由靶蛋白配體、連接體、E3 連接酶配體三部分組成的一個化物分子。連接體將這兩個配體連接起來，其中靶蛋白配體與靶蛋白產(chǎn)生相互作用E3 連接酶配體可與 E3 連接酶相結(jié)合。因此，PROTAC 在與其 E3 連接酶和靶白結(jié)合時形成三元復(fù)合物。通過連接 E3 連接酶，PROTAC 將 POI 置于空間有的位置以促進(jìn)底物泛素化，從而選擇性地降解靶蛋白（圖 2）[43]。這種方法與小分子抑制劑相比，有很多優(yōu)點(diǎn)。第一，在理論上來說，小分抑制劑與靶蛋白結(jié)合后理應(yīng)抑制其活性，例如，恩扎魯胺可與雄激素受體結(jié)合

（ErBb2PPPI3K），以在生長因子刺激時誘導(dǎo) PI3K 的條件性敲低 9（圖 3）。類似于早期的 PROTAC，該降解分子由 VHL 肽結(jié)合片段和多聚-D- ARG 序列組成，以增強(qiáng)細(xì)胞通透性。然而，磷酸 PROTAC 不是用一個小分子配體來募集靶蛋白，而是使用“條件性”蛋白質(zhì)配體，即僅在向細(xì)胞添加生長因子時才結(jié)合其同源伴侶的蛋白質(zhì)配體。這是通過結(jié)合來自受體酪氨酸激酶（例如，ErBb3）的肽序列來實現(xiàn)的，所述受體酪氨酸激酶含有磷酸化位點(diǎn)，其用作下游信號傳導(dǎo)組分（例如，PI3K）的結(jié)合位點(diǎn)。在概念驗證實驗中，生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)磷酸PROTAC 的 ErBb3 和 ErBb3 磷酸化位點(diǎn)，從而導(dǎo)致 PI3K 的募集、泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解。此外，在小鼠異種移植模型中，ErBb2PPPI3K 的治療導(dǎo)致腫瘤大小減少 40%[54]，首次證明了 PROTAC 的體內(nèi)活性。盡管在降解靶蛋白方面效果顯著，也有較好的體內(nèi)抗腫瘤活性，但其分子量高、細(xì)胞通透性差、潛在的代謝不穩(wěn)定性等特性使得 PROTAC 不太可能成為良好的候選藥物。

1.2.3.2.3 VHL 蛋白作為 E3 泛素連接酶第一個廣泛應(yīng)用于小分子選擇性靶蛋白降解的E3連接酶是Cli-RING泛素連接酶（CRL）組分 VHL（圖 5）。通過基于經(jīng)典片段的方法開發(fā)基于羥脯氨酸的HIF1 衍生的 VHL 結(jié)合肽的小分子模擬物，實現(xiàn)了這一突破。該蛋白為 E3 泛素連接酶復(fù)合體Elongin B/C-CUL2-VHL的組成部分。VHL可以使缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF1α）泛素化導(dǎo)致 HIF1α 的降解。2012 年 Buckley 等人發(fā)表了第一個抑制VHL-HIF1α 相互作用的小分子化合物，該 VHL 配體可與 VHL 中 HIF1α 識別位點(diǎn)偶聯(lián)，結(jié)果顯示該 PROTAC 在 100 nm（DC50）下可誘導(dǎo)其靶蛋白 50%的降解。重要的是，這種 PROTAC 被證明在體內(nèi)是有活性的;在使用 PROTAC 治療之后，小鼠心臟，腎臟和 MDA-MB-231 異種移植腫瘤的 ERRα 水平分別降低了約 44%、44%和 39%[47]。因此該設(shè)計被廣泛應(yīng)用于 PROTAC 的設(shè)計中，研究發(fā)現(xiàn)此類PROTAC 可同時降解絲氨酸/蘇氨酸激酶 RIPK2。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;科學(xué)家首次培育出人豬嵌合體胚胎[J];生物學(xué)教學(xué);2017年07期

2 張鎖明;;人豬嵌合體實驗可能培育出聰明的“二師兄”[J];科普童話;2016年41期

3 葉子;;科學(xué)家如何培育“人獸嵌合體”:身為人類的意義將轉(zhuǎn)變[J];科學(xué)大觀園;2017年03期

4 文科訊;;科學(xué)家為何培育嵌合體生物[J];科學(xué)大觀園;2017年04期

5 ;聰明的“二師兄”會出現(xiàn)嗎[J];發(fā)明與創(chuàng)新(中學(xué)生);2017年06期

6 佚名;;讓人恐懼人動物嵌合體[J];科學(xué)大觀園;2017年08期

7 ;人豬雜交只為拯救生命[J];當(dāng)代工人(C版);2017年02期

8 任天文;;并非嵌合體全是人工產(chǎn)物[J];科學(xué)大觀園;2016年20期

9 朱雪云;陳利萍;;植物嵌合體的研究與應(yīng)用[J];核農(nóng)學(xué)報;2010年06期

10 劉和平;林劍波;何業(yè)華;;園藝植物嵌合體研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2010年22期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王詩惠;靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的蛋白降解靶向嵌合體設(shè)計、合成以及生物活性研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 徐碧林;嗜熱、嗜溫及嗜冷蛋白酶嵌合體構(gòu)建及性質(zhì)分析[D];武漢大學(xué);2015年

3 郝燕;高通量測序及相關(guān)技術(shù)在植入前遺傳學(xué)診斷中的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

4 王榮根;大鼠—小鼠嵌合體異種肺器官的研究及GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除豬器官/組織的免疫原性的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

5 王美霞;U_1小核核糖核酸嵌合體核酶靶向抑制HCV表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2004年

6 李素霞;兩種異基因造血干細(xì)胞移植后嵌合體檢測方法的建立和對照研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

7 胡江文;TGF-β_1基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合BMC/MSCs誘導(dǎo)嵌合體在異種心臟移植免疫耐受中作用的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2006年

8 趙明光;用基于SNP分型的實時PCR定量檢測造血干細(xì)胞移植后的嵌合體[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 林國安;嵌合體供者誘導(dǎo)異種皮膚移植免疫耐受的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 肖長虹;免疫缺陷鼠—人RA移植物嵌合體模型的研制及應(yīng)用[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 吳麗梅;泛素化降解靶蛋白的PROTAC嵌合體分子篩選及其構(gòu)效關(guān)系分析[D];浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2019年

2 黃小昆;人—山羊嵌合體肝臟的制備及人源細(xì)胞功能的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

3 于浩;數(shù)字PCR監(jiān)測造血干細(xì)胞移植嵌合體的初步研究及HLA-DPB1與rs9277534連鎖關(guān)系分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

4 孫彤陽;人—非人動物嵌合體研究的倫理與管理[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

5 魯琴;關(guān)于人獸嵌合體技術(shù)的倫理思考[D];武漢科技大學(xué);2008年

6 熊輝霞;非清髓異基因造血干細(xì)胞移植后嵌合體定量檢測的實驗及臨床研究[D];東南大學(xué);2006年

7 王欣欣;人類嵌合體實驗的責(zé)任倫理審視[D];河南師范大學(xué);2015年

8 曹劉素;中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星和煙草曲莖病毒衛(wèi)星的嵌合體種群遺傳變異分析[D];西南大學(xué);2015年

9 閆俊芳;菊花花色嵌合體色素代謝及變異機(jī)理的研究[D];蘇州大學(xué);2014年

10 鐘小蘭;紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞葉綠素合成限速基因挖掘[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2878065