發(fā)布時間：2020-11-10 15:02

　　 蛋白降解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是一種雙功能雜合化合物,一邊用來結合靶蛋白,另一邊用來結合E3連接酶,使得目標蛋白可以與E3連接酶結合,促進靶蛋白泛素化并被蛋白酶體降解。實驗結果表明:與傳統(tǒng)蛋白抑制劑相比較,PROTAC在治療學的發(fā)展中具有廣闊的前景。最新研究證明沙利度胺及其衍生物可以結合到CRBN蛋白上,CRBN能與損傷DNA結合蛋白1(damaged DNA binding protein 1,DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)、Cullins1調(diào)控子(Roc1)結合起來,形成E3泛素連接酶復合物CRL4。該復合物可利用泛素化來標記特定蛋白,隨后水解靶向蛋白。BI2536為PLK1(IC_(50):0.83 nM)和BRD4(IC_(50):25 nM)雙靶點蛋白酶抑制劑,并且其構效關系研究證明其酰胺鍵連接部位為可改造部位。因此本論文以BI2536及其衍生物作為靶蛋白配體,可與PLK1、BRD4結合,沙利度胺類似物作為E3連接酶配體,可與E3連接酶進行結合,選用不同長度和類型的連接體將兩者進行連接,設計合成PROTAC BP系列化合物。并通過對化合物PLK1和BRD4蛋白抑制活性,人肺癌細胞A549和人髓性單核細胞白血病細胞MV4-11細胞增殖抑制活性考察,并篩選出化合物BP-3以及對其MV4-11細胞凋亡的影響,對MV4-11胞中BRD4和PLK1蛋白降解能力和C-Myc蛋白表達進行了考察,對化合物BP-3抗腫瘤作用機制進行研究。同時對其在大鼠中的藥代動力學特征進行了研究。用ELISA方法驗證化合物對PLK1和BRD4蛋白抑制活性,實驗結果表明合成的PROTAC BP系列化合物都呈現(xiàn)很好的BRD4和PLK1蛋白抑制活性。構效關系表明當化合物R結構為芐溴基,BI2536衍生物與沙利度胺類似物連接體為PEG且n=3時,對BRD4和PLK1蛋白抑制活性(BRD4:IC_(50)=12.3 nM;PLK1:IC_(50)=8.9 nM)最強,當連接體長度增加或替換為烷基鏈時對BRD4和PLK1蛋白抑制活性下降。CCK8法進行細胞實驗結果表明,合成的PROTAC BP系列化合物都呈現(xiàn)很好的對人肺癌細胞A549和人髓性單核細胞白血病細胞MV4-11細胞增殖抑制活性。其中化合物BP-2,BP-3和BP-4細胞增殖抑制活性都要優(yōu)于對照化合物BI2536。其中化合物BP-3對A549(IC_(50)=10.8 nM)和MV4-11(IC_(50)=7.6 nM)增殖抑制活性最強。流式細胞術檢測BI2536和化合物BP-3作用MV4-11 24 h后細胞凋亡率結果表明,0、50、100 nM,化合物BP-3誘導MV4-11細胞凋亡率分別為6.2%、26.3%、33.3%。證明化合物BP-3可誘導MV4-11細胞凋亡,且促MV4-11細胞凋亡活性要明顯優(yōu)于對照品BI2536。對MV4-11細胞周期影響研究顯示,化合物BP-3使細胞周期阻滯在G0/G1期,BI2536細胞周期阻滯在G2/M期。MV4-11細胞凋亡相關蛋白表達檢測證明,化合物BP-3誘導MV4-11細胞凋亡可能通過PARP裂解,caspase-3活化和Bcl-2下調(diào)有關。Western-blot實驗結果表明化合物BP-3在20-30 nM濃度可以將BRD4蛋白完全降解;在40-50 nM濃度將PLK1蛋白降解,并且可降低BRD4下游通路中C-Myc蛋白的表達,在40-50 nM濃度C-Myc蛋白表達消失。證明化合物BP-3具有BRD4和PLK1蛋白降解能力,并且因降解BRD4蛋白使下游通道C-Myc蛋白表達減少并消失,并且其蛋白降解能力呈劑量依賴關系�；�合物BP-3在50 nM濃度下與MV4-11細胞轉染12h就可引起B(yǎng)RD4和PLK1明顯降解。證明化合物BP-3對MV4-11細胞中BRD4和PLK1蛋白具有強效、快速的降解能力。MV4-11細胞移植SCID小鼠體內(nèi)實驗證明,化合物BP-3,BI2536都能明顯抑制腫瘤的增長,但相同劑量下化合物BP-3抑制效果要優(yōu)于BI2536。同時腫瘤組織BRD4,PLK1和C-Myc蛋白表達顯示,化合物BP-3可通過使PLK1和BRD4蛋白降解,并降低C-Myc蛋白表達來達到抑制腫瘤生長作用。同時本論文對化合物BP-3大鼠體內(nèi)藥代動力學進行了研究,建立了應用高效液相色譜法(HPLC)測定化合物BP-3血藥濃度的方法,結果表明,該方法專屬性高,精密度、準確度良好,血漿樣品處理采用沉淀法,操作簡單,能夠滿足化合物BP-3的藥代動力學研究。通過體外體內(nèi)生物活性實驗證明,本論文設計合成的化合物BP-3可快速、有效的降解BRD4和PLK1蛋白,并使C-Myc蛋白表達降低,同時具有很好的腫瘤生長抑制能力。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

TX2-121-1 TX2-135-2 TX2-120-1圖 2 疏水標記（HyT）技術開發(fā)的化合物結構1.2.3 蛋白降解靶向嵌合體技術PROTACs 是由靶蛋白配體、連接體、E3 連接酶配體三部分組成的一個化物分子。連接體將這兩個配體連接起來，其中靶蛋白配體與靶蛋白產(chǎn)生相互作用E3 連接酶配體可與 E3 連接酶相結合。因此，PROTAC 在與其 E3 連接酶和靶白結合時形成三元復合物。通過連接 E3 連接酶，PROTAC 將 POI 置于空間有的位置以促進底物泛素化，從而選擇性地降解靶蛋白（圖 2）[43]。這種方法與小分子抑制劑相比，有很多優(yōu)點。第一，在理論上來說，小分抑制劑與靶蛋白結合后理應抑制其活性，例如，恩扎魯胺可與雄激素受體結合

（ErBb2PPPI3K），以在生長因子刺激時誘導 PI3K 的條件性敲低 9（圖 3）。類似于早期的 PROTAC，該降解分子由 VHL 肽結合片段和多聚-D- ARG 序列組成，以增強細胞通透性。然而，磷酸 PROTAC 不是用一個小分子配體來募集靶蛋白，而是使用“條件性”蛋白質(zhì)配體，即僅在向細胞添加生長因子時才結合其同源伴侶的蛋白質(zhì)配體。這是通過結合來自受體酪氨酸激酶（例如，ErBb3）的肽序列來實現(xiàn)的，所述受體酪氨酸激酶含有磷酸化位點，其用作下游信號傳導組分（例如，PI3K）的結合位點。在概念驗證實驗中，生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白誘導磷酸PROTAC 的 ErBb3 和 ErBb3 磷酸化位點，從而導致 PI3K 的募集、泛素化和蛋白酶體介導的降解。此外，在小鼠異種移植模型中，ErBb2PPPI3K 的治療導致腫瘤大小減少 40%[54]，首次證明了 PROTAC 的體內(nèi)活性。盡管在降解靶蛋白方面效果顯著，也有較好的體內(nèi)抗腫瘤活性，但其分子量高、細胞通透性差、潛在的代謝不穩(wěn)定性等特性使得 PROTAC 不太可能成為良好的候選藥物。

1.2.3.2.3 VHL 蛋白作為 E3 泛素連接酶第一個廣泛應用于小分子選擇性靶蛋白降解的E3連接酶是Cli-RING泛素連接酶（CRL）組分 VHL（圖 5）。通過基于經(jīng)典片段的方法開發(fā)基于羥脯氨酸的HIF1 衍生的 VHL 結合肽的小分子模擬物，實現(xiàn)了這一突破。該蛋白為 E3 泛素連接酶復合體Elongin B/C-CUL2-VHL的組成部分。VHL可以使缺氧誘導因子-1α（HIF1α）泛素化導致 HIF1α 的降解。2012 年 Buckley 等人發(fā)表了第一個抑制VHL-HIF1α 相互作用的小分子化合物，該 VHL 配體可與 VHL 中 HIF1α 識別位點偶聯(lián)，結果顯示該 PROTAC 在 100 nm（DC50）下可誘導其靶蛋白 50%的降解。重要的是，這種 PROTAC 被證明在體內(nèi)是有活性的;在使用 PROTAC 治療之后，小鼠心臟，腎臟和 MDA-MB-231 異種移植腫瘤的 ERRα 水平分別降低了約 44%、44%和 39%[47]。因此該設計被廣泛應用于 PROTAC 的設計中，研究發(fā)現(xiàn)此類PROTAC 可同時降解絲氨酸/蘇氨酸激酶 RIPK2。
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本文編號：2878065