腫瘤靶向治療是新型給藥系統(tǒng)研究領(lǐng)域的一大命題,靶向系統(tǒng)可提高腫瘤組織的藥物濃度、增強(qiáng)藥效,同時(shí)降低毒副作用。除了使用傳統(tǒng)的納米靶向制劑,還可以通過(guò)生物載體實(shí)現(xiàn)藥物的遞送。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有腫瘤趨向特性的成體干細(xì)胞,在細(xì)胞治療、組織再生和免疫治療等方面有廣泛的應(yīng)用。將MSCs作為藥物載體,可實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。本文以MSCs與腫瘤細(xì)胞表面共表達(dá)受體CD44為著眼點(diǎn),合成了透明質(zhì)酸-b-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(HA-b-PLGA)聚合物,以該聚合物作為載體,制備了載有紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的PTX-HA-PLGA膠束。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞方式將膠束載入MSCs中,構(gòu)建出嵌有載藥膠束的MSCs生物靶向系統(tǒng)(MSCs-Micelles)。該系統(tǒng)通過(guò)CD44介導(dǎo)的內(nèi)吞增加了MSCs的載藥量,同時(shí)膠束包裹避免了藥物與MSCs的直接接觸,降低PTX對(duì)MSCs的毒性,維持了 MSCs的腫瘤歸巢能力。腦對(duì)側(cè)半球注射后,在腦膠質(zhì)瘤區(qū)域可觀察到MSCs和藥物的廣泛分布。通過(guò)增加PTX從MSCs中釋放的總量和釋放時(shí)間,MSCs-Micelles提高了遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度,增強(qiáng)了抗腫瘤活性,顯著延長(zhǎng)了腦膠質(zhì)瘤原位移植模型大鼠的生存期。為了制備聚合物膠束,本文首先合成了三種不同分子量的HA-b-PLGA502H聚合物(HA分子量分別為5.8,6.7,9.1 kDa)。通過(guò)還原胺化法在HA末端連接1,4-丁二胺,使其與PLGA琥珀酰亞胺酯反應(yīng)縮合生成HA-b-PLGA聚合物,使用1H-NMR和GPC對(duì)聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。采用芘熒光探針光譜法測(cè)定HA-b-PLGA 聚合物的 臨界膠束濃度(Critical micelle concentration,CMC)。結(jié)果表明CMC值隨著HA分子量的增大而增大,HA5.8k-b-PLGA,HA6.7k-b-PLGA和HA9.1k-b-PLGA 對(duì)應(yīng)的 CMC 分別是 1.42 mg/L,2.08 mg/L和 2.84 mg/L。采用溶劑-透析法制備HA-PLGA空白膠束,膠束粒徑隨HA分子量增加而變大,zeta電位均保持在-15.0 mV～-16.0 mV之間。本文選用具有小粒徑且低CMC值的HA5.8k-b-PLGA502H 制備 PTX-HA-PLGA 膠束,用于后續(xù)的 MSCs-Micelles 系統(tǒng)的構(gòu)建。為獲得較高的包封率和載藥量,我們對(duì)聚合物濃度和PTX/聚合物比例進(jìn)行篩選,最終確定以2mg/mL的共聚物濃度,PTX/聚合物比例為1:20的最優(yōu)處方來(lái)制備PTX-HA-PLGA膠束。透射電鏡(TEM)可觀察到聚合物膠束經(jīng)典的核-殼結(jié)構(gòu),采用HPLC測(cè)定其包封率達(dá)53.64 ±1.08%,載藥量為2.57 ±0.03%。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明膠束具有緩釋效果,3天可累積釋放超過(guò)50%。MTT法考察載藥膠束對(duì)MSCs和大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明兩種細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性存在顯著差異,HA-PLGA-PTX膠束對(duì)MSCs的IC50(1226.81 ± 20.53 ng/mL)顯著高于 C6 細(xì)胞(3.8 ± 0.14 ng/mL),兩者相差300多倍,有利于MSCs在安全范圍內(nèi)攜載和遞送藥物至C6細(xì)胞,并產(chǎn)生抗腫瘤活性。與PTX溶液組相比,膠束包裹可有效避免MSCs與PTX的接觸,增加了 MSCs對(duì)PTX的耐受性,有利于提高M(jìn)SCs的載藥量。以6-香豆素作為熒光探針,對(duì)MSCs的膠束攝取情況和攝取機(jī)制進(jìn)行考察。飽和攝取及內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)表明MSCs通過(guò)CD44介導(dǎo)的內(nèi)吞提高對(duì)膠束的攝取,并通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和小窩蛋白依賴性的內(nèi)吞途徑參與內(nèi)化過(guò)程。本文考察了與不同濃度的載藥膠束孵育后,MSCs細(xì)胞周期和體外細(xì)胞遷移能力的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在中劑量組,MSCs分別在撤藥3天和5天后恢復(fù)細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞周期,確定MSCs與8 ng/mL載藥膠束孵育8小時(shí)用于后續(xù)MSCs-Micelles的構(gòu)建,該生物系統(tǒng)載藥量為1.3 pgPTX/cell。隨后我們對(duì)MSCs-Micelles的體外釋放行為進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明MSCs釋放藥物呈先快后慢的雙相釋放過(guò)程。前6小時(shí)釋放快速,而后速度變慢,5天內(nèi)可持續(xù)釋出藥物。約25%、40%和62%的PTX可分別從 MSCs-PTX,MSCs-NPs 和 MSCs-Micelles 釋放,5 天釋放總量為 0.232 pg/cell,0.379 pg/cell 和 0.792 pg/cell。相比于 MSCs-PTX,MSCs-Micelles 有利于提高藥物釋放量。為考察MSCs-Micelles釋放的藥物是否能夠被C6有效攝取,并產(chǎn)生抗腫瘤作用,我們進(jìn)行了 Transwell系統(tǒng)中C6細(xì)胞對(duì)PTX的攝取動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。MSCs-NPs和MSCs-Micelles組下室C6細(xì)胞內(nèi)PTX量分別為0.03688 ±0.00034 pg/cell 和 0.04825 ± 0.00042 pg/cell,膠束組是納米粒組的 1.3 倍。MSCs-Micelles對(duì)C6有顯著的抗腫瘤活性,其作用呈藥物劑量和MSCs細(xì)胞數(shù)依賴關(guān)系。通過(guò)與8ng/mLPTX-HA-PTX膠束孵育構(gòu)建MSCs-Micelles,MSCs-Micelles與腫瘤細(xì)胞比例為1:5時(shí),C6細(xì)胞存活率為50%。在3D腫瘤球模型上,我們分別對(duì)MSCs和所負(fù)載藥物的腫瘤球滲透能力和腫瘤球活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,在腫瘤球邊緣和內(nèi)部均能夠看到MSCs,說(shuō)明載藥MSCs不僅能夠向腫瘤遷移,并且還能夠向腫瘤內(nèi)部滲透。經(jīng)HA修飾后,MSCs-Micelles表現(xiàn)出更深的滲透。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)3D瘤體活力進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明MSCs-Micelles可誘導(dǎo)腫瘤球細(xì)胞凋亡,效果呈劑量和MSCs數(shù)量依賴。最后,我們?cè)诖笫笤荒X膠質(zhì)瘤模型上通過(guò)腦半球?qū)?cè)給藥方式研究了MSCs-Micelles體內(nèi)靶向效果和抗膠質(zhì)瘤活性。制備了載有Oregon Green(?)488熒光PTX(PTX-Flu)的載藥膠束,并將其嵌載于MSCs,并對(duì)MSCs進(jìn)行CM-Dil標(biāo)記,觀察MSCs-Micelles的腦內(nèi)分布情況。MSCs注射2天后,可在腫瘤區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量、散在分布的MSCs。而在注射部位只有少量MSCs成簇分布,證明了 MSCs-Micelles體內(nèi)對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤的歸巢能力。同時(shí),在腫瘤部位可觀察到大量的藥物綠色熒光,通過(guò)共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大部分PTX-Flu已被MSCs-Micelles釋放�？鼓z質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)中,腦半球?qū)?cè)單次注射(1 μg/kgPTX)后,MSC-Micelles組的大鼠在意識(shí)或運(yùn)動(dòng)反應(yīng)方面沒(méi)有明顯的異常,生存期顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。Saline組、MSCs組、PTX-HA-PLGA組、MSCs-PTX組、MSC-NPs組和MSC-Micelles治療組中位生存時(shí)間分別是14.5天、13.5天、22.5天、23.5天、38.5天和60天。對(duì)腦組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)經(jīng)Saline和MSCs空白組處理后均顯示出大片腫瘤組織,腫瘤占位明顯。PTX治療組均表現(xiàn)出明顯的腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡。而在MSCs-Micelles組中膠質(zhì)瘤區(qū)域的最顯著減少,無(wú)明顯腫瘤組織可見(jiàn)。綜上結(jié)果表明所構(gòu)建的MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)在體內(nèi)可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R965
【部分圖文】：
本文通過(guò)丁二胺將ＨＡ連接到ＰＬＧＡ末端上，該方法操作簡(jiǎn)單，效率高。??將丁二胺化的ＨＡ與ＰＬＧＡ－ＮＨＳ縮合，形成以ＰＬＧＡ為疏水端，ＨＡ為親水端??的ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ嵌段共聚物（圖１．１）。??Ａ擊。傅??ＨＡ??ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＨ?ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＭ??ＯＨ?ＮＨＣＯＣＨ３?ＯＨＪ＾?ＮＨＣＣＴＣＨａ??ａｍｉｍｉｔｒｄ?ＨＡ??〇?〇〇??ＰＬＧＡ?ＰＬＧＡ＞ＮＩＩＳ??＋??＊ｍｉｉＭｆｒｄ?ＨＡ??Ｎ．Ｎ－ｄｍ〇ｆｉｆａｐｙｌｃｉｈｙｉ？ｎｍｅ??ＣＯＯＨ?ＣＨ，ＯＨ?ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＨ??ＯＨ?ＮＨＣＯＣＨｊ?ＯＨ?ＮＨＣＯ＾＾ｊ?〇??ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ??圖１．１?ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物合成步驟（Ａ）?丁二胺化ＨＡ的合成（Ｂ）?ＰＬＧＡ－??ＮＨＳ與丁二胺化ＨＡ縮合形成ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物??８??
觀察到?ＰＬＧＡ?的特征峰：１．４６?ｐｐｍ?（３Ｈ，－ＣＨ３）、５．２５?ｐｐｍ?（２Ｈ，－０ＣＨ２－Ｃ＝０）??和４．９１?ｐｐｍ?（?－ＣＨ－）。當(dāng)ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物溶解在ＤＭＳＯ－ｄ６中時(shí)，譜圖上同??時(shí)出現(xiàn)ＰＬＧＡ和ＨＡ的特征峰（圖１．２ｃ４－ｃ５，ｃｌ－ｃ３）。而當(dāng)ＰＬＧＡ－ｂ－ＨＡ聚合物??９??
?第１章載藥膠束的制備及表征??溶解在Ｄ２０時(shí)，譜圖上只出現(xiàn)ＨＡ的特征峰（圖１．２ｄ４－ｄ５），而不再檢測(cè)到??ＰＬＧＡ的質(zhì)子信號(hào)，這是由于ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ在水中形成核－殼膠束結(jié)構(gòu)，其??ＰＬＧＡ核被屏蔽。然而當(dāng)共聚物溶解在ＤＭＳＯ－ｄ６中時(shí)，由于ＰＬＧＡ鏈被完全拉??伸，故ＨＡ和ＰＬＧＡ都可以看到信號(hào)。??采用ＧＰＣ測(cè)定得到ＰＬＧＡ與ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物的重均分子量，分別為??１９４８０?ｇ／ｍｏｌ與２３８５１?ｇ／ｍｏｌ，經(jīng)ＨＡ嵌段后的聚合物與ＰＬＧＡ相差的量（４３７１??ｇ／ｍｏｌ）與增加的ＨＡ的分子量（５７６３?ｇ／ｍｏ］）基本相近。??綜上，Ｗ－ＮＭＲ和ＧＰＣ結(jié)果表明ＨＡ被成功偶聯(lián)到ＰＬＧＡ上。??隨后，為進(jìn)一步考察不同分子量的ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物對(duì)ＣＭＣ的影響，本??實(shí)驗(yàn)中采用芘熒光探針?lè)?
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本文編號(hào)：
2877889
