發(fā)布時間：2020-11-10 09:05

　　 背景鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di(2-ethylhexy1)phthalate,DEHP]為代表的鄰苯二甲酸酯類塑化劑是公認的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EEDs)�？赏高^人體血-睪屏障、血-腦屏障,破壞人體的生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)。DEHP經(jīng)人體吸收,可快速水解為鄰苯二甲酸單乙基乙酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP],在人體長期蓄積,產(chǎn)生生殖毒性和雌激素效應。5-氨基熒光素(5-Aminofluorescein,5-AF)是一小分子化學物質(zhì),是氨基類熒光素。其活性氨基基團能與生物分子中的羧基結(jié)合,結(jié)合后熒光強度大大增強,因而廣泛應用于蛋白質(zhì)分析和免疫學研究。目的合成具有熒光示蹤的MEHP,旨在用于細胞及分子水平的毒性機理研究。方法1.MEHP與5-氨基熒光素(5-AF)經(jīng)酰胺脫水縮合反應制備MEHP衍生物熒光探針(MEHP-AF)。2.MEHP-AF純化后經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、傅里葉變換紅外光譜等進行純度、結(jié)構鑒定,以熒光穩(wěn)態(tài)和熒光瞬態(tài)進行探針的熒光特性分析。3.實驗以Hela細胞為對象,比較5-AF與MEHP-AF的性能差異;以時間為變量研究MEHP-AF的入胞特征;以藻紅蛋白標記的雌激素受體(estrogen receptor,ER)抗體定位Hela細胞探討MEHP-AF與ER的相互作用。結(jié)果1.MEHP-AF為結(jié)構全新的化合物。分子式為C36H33N08,分子量為607.65。2.理化特征表明,MEHP-AF為紅褐色油狀物。與MEHP化學性質(zhì)相似,不溶于水,而溶解氯仿、乙醇等有機溶劑。經(jīng)純化后的MEHP-AF的純度含量達92.4%。3.5-AF與MEHP-AF的性能差異結(jié)果表明,水溶性的5-AF在濃度高達100 μM難以進入細胞內(nèi),而MEHP-AF在濃度低至1 μM即可分布至細胞質(zhì)與細胞核。在15 min可見MEHP--AF透過細胞膜進入胞質(zhì),少量達到細胞核;隨著作用時間增加進入到細胞核的量也明顯增加。ER為核受體,也可分布在細胞膜與細胞質(zhì)。MEHP-AF能與ER結(jié)合呈現(xiàn)出黃色熒光,熒光密度隨作用時間延長而更強。結(jié)論MEHP-AF作為一種新穎的熒光探針,它具有MEHP的脂溶性和5-AF的熒光特性。能在靶細胞原位、實時及可視化進行MEHP的亞細胞及分子水平的毒性機制研究。
【學位單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R99;O657.3
【部分圖文】：

DEHP的代謝[來自KochFIM等.200習Fig2.MetabolismofDEHP(accordingKochetx1.2005)

５．４實驗結(jié)果??５．４．１傅里葉變換紅外光譜檢測??如圖５所示，對ＭＥＨＰ－ＡＦ、ＭＥＨＰ、５－ＡＦ進行了傅里葉變換紅外光譜檢測。??在５－ＡＦ的光譜中，在－ＮＨ２－的伸縮振動區(qū)間３５００?ｃｎｒＭｌＯＯｃｎｒ１內(nèi)，藍箭頭所指??區(qū)域出現(xiàn)了相應的伸縮振動。在ＭＥＨＰ的光譜圖中，在飽和鏈烴－ＣＨ２－的伸縮振??動區(qū)間３０００?ｃｍ－ＷｅＯＯ?ｃｎｒ１和－Ｃ＝０的伸縮振動區(qū)間１８２０?ｃｎ＾－ｉｅＳＯ?ｃｍ－１內(nèi)，紅??箭頭所指的相應位置出現(xiàn)了伸縮振動，并且出現(xiàn)了羧基羰基和酯基羰基對稱雙羰??基伸縮振動。產(chǎn)物ＭＥＨＰ－ＡＦ的紅外光譜中，在－ＮＨ２－的伸縮振動區(qū)間３５００??內(nèi)，出現(xiàn)了相應的伸縮振動，但是，振動巾ｇ度明顯降低，表明氨基??鏈接基團改變。在－ＣＨ２－的伸縮振動區(qū)間３０００?ｃｎ＾ＪＳＯＯ?ｃｍ－１和－Ｃ＝０的伸縮振??動區(qū)間１８２０?ｃｎｒＭＳａＯ?ｃｒｒｒ１內(nèi)，黑色箭頭所指部位均出現(xiàn)了相應的伸縮振動，在??－Ｃ＝０的伸縮振動區(qū)域

?５．４．２液相色譜－質(zhì)譜（ＨＰＬＣ－ＭＳ）檢測??如圖６?（Ａ）所示，該流動相條件下，ＭＥＨＰ－ＡＦ，?ＭＥＨＰ，５－ＡＦ，可以完全??分離。５－ＡＦ保留時間２．１６ｍｉｎ，?ＭＥＨＰ的保留時間為２７．４２ｍｉｎ。ＭＥＨＰ－ＡＦ及少??量雜質(zhì)的保留時間分別為４．９７ｍｉｎ、３．４０ｍｉｎ，峰面積之比為０．９２４。ＨＰＬＣ說明??了?ＭＥＨＰ－ＡＦ的產(chǎn)物中沒有５－ＡＦ的殘留，且純度為９２．４％。６（Ｂ）圖是ＭＥＨＰ－ＡＦ??的負相質(zhì)譜圖，６０６．１０與理論計算ＭＥＨＰ－ＡＦ的相對分子質(zhì)量６０７去掉一個氫原??子一致。液相色譜－質(zhì)譜的結(jié)果說明，ＭＥＨＰ－ＡＦ成功合成。??Ａ??ＭＥＨＰ－ＡＦ?Ｂ????．ｉｒｔ９?１?－Ｅ５ｉ?Ｓｃａｎ?１－３．ｉ??Ｖ??Ｗｃｎｒ＊?．??■?｜?——５－ＡＦ?Ｔ??？?ｒ４?６５??Ｓ－??ｆ：?．?Ｉ?：：??－?￣￣?????????３Ｓ－??＾?Ｉ??－?Ｉ?７？＊?１３??．？５．３Ｃ??．Ｉ?１?？．…?—??〇?５?１Ｑ?１５?２０?２５?３０?？：ｓ?ｆｋ?ｍ?＊ａ?ｓｏ：?ｅｓａ?７３ｃ?ｓｃｓ?９５Ｃ?ｉｃ－５－ｓ??Ｃｏｕｒｔｓ?？ｔ）?Ｍ？ｗ！０－Ｃｈ？ｉｇｏ?＇ｒｒ＇ｌｉ??Ｒ．Ｔｉｎｉｅ（ｍｉｎ）??圖６．?ＨＰＬＣ－ＭＳ下
【參考文獻】

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1 鄭紅燕;饒凱敏;姜英;楊光濤;陳曦;王建書;汪倩;王晶;袁晶;;鄰苯二甲酸單(2-乙基)己酯對MCF-7細胞DNA的氧化損傷[J];癌變·畸變·突變;2012年01期

2 胡存麗;仲來福;;鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯遺傳毒性研究進展[J];大連醫(yī)科大學學報;2007年02期

3 王哲清;;實用高效的酰胺鍵形成試劑[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;2006年12期

4 宋曉峰;魏光輝;鄧永繼;陳璇;劉星;張德迎;;鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯對原代培養(yǎng)小鼠胚胎睪丸Leydig細胞功能影響研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2006年12期

5 趙文紅,厲曙光;DEHP染毒后小鼠各臟器含量的測定及其意義[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2005年03期

6 劉欣,王紅,張華山;生物分析中近紅外熒光探針進展[J];分析科學學報;2001年04期

本文編號：2877755