發(fā)布時間：2020-11-10 09:05

　　 背景鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di(2-ethylhexy1)phthalate,DEHP]為代表的鄰苯二甲酸酯類塑化劑是公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EEDs)�？赏高^人體血-睪屏障、血-腦屏障,破壞人體的生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)。DEHP經(jīng)人體吸收,可快速水解為鄰苯二甲酸單乙基乙酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP],在人體長期蓄積,產(chǎn)生生殖毒性和雌激素效應(yīng)。5-氨基熒光素(5-Aminofluorescein,5-AF)是一小分子化學(xué)物質(zhì),是氨基類熒光素。其活性氨基基團(tuán)能與生物分子中的羧基結(jié)合,結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng),因而廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析和免疫學(xué)研究。目的合成具有熒光示蹤的MEHP,旨在用于細(xì)胞及分子水平的毒性機(jī)理研究。方法1.MEHP與5-氨基熒光素(5-AF)經(jīng)酰胺脫水縮合反應(yīng)制備MEHP衍生物熒光探針(MEHP-AF)。2.MEHP-AF純化后經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、傅里葉變換紅外光譜等進(jìn)行純度、結(jié)構(gòu)鑒定,以熒光穩(wěn)態(tài)和熒光瞬態(tài)進(jìn)行探針的熒光特性分析。3.實驗以Hela細(xì)胞為對象,比較5-AF與MEHP-AF的性能差異;以時間為變量研究MEHP-AF的入胞特征;以藻紅蛋白標(biāo)記的雌激素受體(estrogen receptor,ER)抗體定位Hela細(xì)胞探討MEHP-AF與ER的相互作用。結(jié)果1.MEHP-AF為結(jié)構(gòu)全新的化合物。分子式為C36H33N08,分子量為607.65。2.理化特征表明,MEHP-AF為紅褐色油狀物。與MEHP化學(xué)性質(zhì)相似,不溶于水,而溶解氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑。經(jīng)純化后的MEHP-AF的純度含量達(dá)92.4%。3.5-AF與MEHP-AF的性能差異結(jié)果表明,水溶性的5-AF在濃度高達(dá)100 μM難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),而MEHP-AF在濃度低至1 μM即可分布至細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。在15 min可見MEHP--AF透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì),少量達(dá)到細(xì)胞核;隨著作用時間增加進(jìn)入到細(xì)胞核的量也明顯增加。ER為核受體,也可分布在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)。MEHP-AF能與ER結(jié)合呈現(xiàn)出黃色熒光,熒光密度隨作用時間延長而更強(qiáng)。結(jié)論MEHP-AF作為一種新穎的熒光探針,它具有MEHP的脂溶性和5-AF的熒光特性。能在靶細(xì)胞原位、實時及可視化進(jìn)行MEHP的亞細(xì)胞及分子水平的毒性機(jī)制研究。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R99;O657.3
【部分圖文】：

DEHP的代謝[來自KochFIM等.200習(xí)Fig2.MetabolismofDEHP(accordingKochetx1.2005)

５．４實驗結(jié)果??５．４．１傅里葉變換紅外光譜檢測??如圖５所示，對ＭＥＨＰ－ＡＦ、ＭＥＨＰ、５－ＡＦ進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜檢測。??在５－ＡＦ的光譜中，在－ＮＨ２－的伸縮振動區(qū)間３５００?ｃｎｒＭｌＯＯｃｎｒ１內(nèi)，藍(lán)箭頭所指??區(qū)域出現(xiàn)了相應(yīng)的伸縮振動。在ＭＥＨＰ的光譜圖中，在飽和鏈烴－ＣＨ２－的伸縮振??動區(qū)間３０００?ｃｍ－ＷｅＯＯ?ｃｎｒ１和－Ｃ＝０的伸縮振動區(qū)間１８２０?ｃｎ＾－ｉｅＳＯ?ｃｍ－１內(nèi)，紅??箭頭所指的相應(yīng)位置出現(xiàn)了伸縮振動，并且出現(xiàn)了羧基羰基和酯基羰基對稱雙羰??基伸縮振動。產(chǎn)物ＭＥＨＰ－ＡＦ的紅外光譜中，在－ＮＨ２－的伸縮振動區(qū)間３５００??內(nèi)，出現(xiàn)了相應(yīng)的伸縮振動，但是，振動巾ｇ度明顯降低，表明氨基??鏈接基團(tuán)改變。在－ＣＨ２－的伸縮振動區(qū)間３０００?ｃｎ＾ＪＳＯＯ?ｃｍ－１和－Ｃ＝０的伸縮振??動區(qū)間１８２０?ｃｎｒＭＳａＯ?ｃｒｒｒ１內(nèi)，黑色箭頭所指部位均出現(xiàn)了相應(yīng)的伸縮振動，在??－Ｃ＝０的伸縮振動區(qū)域

?５．４．２液相色譜－質(zhì)譜（ＨＰＬＣ－ＭＳ）檢測??如圖６?（Ａ）所示，該流動相條件下，ＭＥＨＰ－ＡＦ，?ＭＥＨＰ，５－ＡＦ，可以完全??分離。５－ＡＦ保留時間２．１６ｍｉｎ，?ＭＥＨＰ的保留時間為２７．４２ｍｉｎ。ＭＥＨＰ－ＡＦ及少??量雜質(zhì)的保留時間分別為４．９７ｍｉｎ、３．４０ｍｉｎ，峰面積之比為０．９２４。ＨＰＬＣ說明??了?ＭＥＨＰ－ＡＦ的產(chǎn)物中沒有５－ＡＦ的殘留，且純度為９２．４％。６（Ｂ）圖是ＭＥＨＰ－ＡＦ??的負(fù)相質(zhì)譜圖，６０６．１０與理論計算ＭＥＨＰ－ＡＦ的相對分子質(zhì)量６０７去掉一個氫原??子一致。液相色譜－質(zhì)譜的結(jié)果說明，ＭＥＨＰ－ＡＦ成功合成。??Ａ??ＭＥＨＰ－ＡＦ?Ｂ????．ｉｒｔ９?１?－Ｅ５ｉ?Ｓｃａｎ?１－３．ｉ??Ｖ??Ｗｃｎｒ＊?．??■?｜?——５－ＡＦ?Ｔ??？?ｒ４?６５??Ｓ－??ｆ：?．?Ｉ?：：??－?￣￣?????????３Ｓ－??＾?Ｉ??－?Ｉ?７？＊?１３??．？５．３Ｃ??．Ｉ?１?？．…?—??〇?５?１Ｑ?１５?２０?２５?３０?？：ｓ?ｆｋ?ｍ?＊ａ?ｓｏ：?ｅｓａ?７３ｃ?ｓｃｓ?９５Ｃ?ｉｃ－５－ｓ??Ｃｏｕｒｔｓ?？ｔ）?Ｍ？ｗ�。埃�Ｃｈ？ｉｇｏ?＇ｒｒ＇ｌｉ??Ｒ．Ｔｉｎｉｅ（ｍｉｎ）??圖６．?ＨＰＬＣ－ＭＳ下
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2877755