發(fā)布時間：2020-11-10 07:56

　　 目前肺炎克雷伯菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性,治療其引起的相關(guān)疾病成為臨床上急待解決的難題。它與鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌被稱為21世紀(jì)重癥病房三大難以治療的病原菌。因此,我們急需尋找新型藥物來治療多藥耐藥肺炎克雷伯菌引起的感染�？咕�肽的分子量小,熱穩(wěn)定性強,免疫原性低,具有很好的殺菌活性,而且不易產(chǎn)生耐藥性。抗菌肽因其獨特的殺菌機理而成為近年來的研究熱點。Temporin-1CEb是本實驗室從林蛙皮膚分泌物中分離純化的天然抗菌肽,具有一定的抗菌活性。實驗室前期以Temporin-1CEb為模板,通過賴氨酸、亮氨酸和色氨酸殘基的替代,得到一系列含色氨酸的抗菌肽。這些含色氨酸系列抗菌肽對耐藥銅綠假單胞菌和耐藥表皮葡萄球菌等革蘭氏陰性和陽性細菌均具有高的殺菌活性,而且對細菌的細胞膜具有一定的破壞作用。本文研究了含色氨酸系列抗菌肽對臨床分離的多藥耐藥肺炎克雷伯菌(MRKP1203)的殺菌活性、作用機制以及對小鼠肺部感染MRKP1203的治療作用。含色氨酸系列抗菌肽對MRKP1203菌株顯示了良好的抗菌活性,MIC值為12.5-50μM,其中I4W與I1WL5W有較強的抗菌活性,其MIC值均為12.5μM。殺菌動力學(xué)實驗結(jié)果表明含色氨酸系列抗菌肽對MRKP1203的殺菌活性與其濃度及作用時間呈正比,I4W、L12W和I1WL5W處理的細菌分別在16×MIC、120 min,16×MIC、180 min和8×MIC、180 min時全部死亡�？股�素后效應(yīng)實驗(PAE)研究了經(jīng)抗菌肽處理后的細菌恢復(fù)對數(shù)生長期所需的時間。結(jié)果表明,經(jīng)含色氨酸系列抗菌肽處理后的MRKP1203的抗生素后效應(yīng)時間為2-5 h。掃描電鏡觀察不同濃度抗菌肽對MRKP1203形態(tài)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,經(jīng)2×MIC的I4W、L12W和I1WL5W處理后,MRKP1203菌株的表面粗糙,細胞膜內(nèi)陷,細菌細胞中的物質(zhì)外泄,致使細菌死亡。隨后研究了含色氨酸系列抗菌肽對MRKP1203菌株細胞外膜和內(nèi)膜通透性的影響。細胞膜去極化實驗結(jié)果顯示,加入I4W、L12W和I1WL5W僅1 min,DiSC3-5熒光值顯著增加,當(dāng)肽濃度增加到4×MIC時,三種抗菌肽中DiSC3-5熒光值分別增加了68%、59.5%和72.4%;陽性對照TritonX-100增加了90%,而陰性對照萬古霉素僅增加了27%。這一結(jié)果提示含色氨酸系列抗菌肽可以誘導(dǎo)MRKP1203菌株細胞膜發(fā)生去極化,增加細胞膜的通透性。含色氨酸系列抗菌肽中的色氨酸殘基在波長340 nm處有特異的熒光吸收,當(dāng)色氨酸的側(cè)鏈插入細胞膜中,其熒光光譜會發(fā)生改變。我們選擇含色氨酸系列抗菌肽與MRKP1203菌懸液相互作用,測定色氨酸殘基熒光光譜的變化。實驗結(jié)果顯示3個含色氨酸系列抗菌肽在MRKP1203細菌溶液中,色氨酸殘基在340 nm的吸收峰發(fā)生了不同程度的藍移,其中I1WL5W藍移效果最明顯,為32 nm;I4W和L12W藍移30 nm和26 nm。該結(jié)果提示含色氨酸系列抗菌肽中的色氨酸殘基能夠插入到MRKP1203菌的膜磷脂雙分子層中,破壞細胞膜的穩(wěn)定性,從而殺死細菌。人工模擬肺炎克雷伯菌細胞膜通透性的影響實驗結(jié)果也同樣顯示含色氨酸系列抗菌肽增加了細菌細胞膜的通透性。I4W、L12W和I1WL5W分別在濃度為6.25μM、12.5μM和6.25μM時使鈣黃綠素的釋放達到100%。以上實驗證明了含色氨酸系列抗菌肽能夠使MRKP1203菌株細胞膜的通透性發(fā)生改變,膜的完整性受到破壞。進一步地,我們利用疏水性的熒光探針NPN檢測了含色氨酸系列抗菌肽對MRKP1203菌外膜通透性的影響。結(jié)果顯示3個含色氨酸系列抗菌肽可以不同程度的增加MRKP1203外膜的通透性,且呈濃度依賴性。接下來我們進行了激光共聚焦實驗,實驗結(jié)果顯示,加入抗菌肽后,綠色的活細菌數(shù)量與對照組相比明顯減少,而紅色的死細菌數(shù)量增加,且隨著抗菌肽濃度的增加,細菌死亡數(shù)量也隨之增長;當(dāng)I4W和I1WL5W濃度增加到25μM時,視野內(nèi)90%以上都是呈紅色熒光的死細菌。這一結(jié)果提示含色氨酸系列抗菌肽能夠破壞MRKP1203細胞膜的完整性。在含色氨酸系列抗菌肽I1WL5W治療小鼠肺部感染MRKP1203菌株的實驗中,通過對小鼠肺組織和血液中的菌落數(shù)、炎癥因子TNF-α和IL-6含量的檢測,以及肺組織的組織化學(xué)染色,分析I1WL5W對肺部感染小鼠的治療作用。實驗結(jié)果顯示不同劑量(2、4和8 mg/kg)的I1WL5W作用肺部感染小鼠3天后,血液中細菌數(shù)量與模型組相比,下降了10-25.39%;TNF-α和IL-6分別降低了17.09-23.27%和7.42-10.35%;治療6天后,血液中細菌數(shù)量與模型組相比,減少了42.72-84.98%;TNF-α和IL-6分別降低了31.42-48.94%和19.71-41.17%;治療9天后,血液中細菌數(shù)量與模型組相比,減少了54.58-92.24%;TNF-α和IL-6分別降低了33.52-89.71%和51.58-87.45%。小鼠肺部組織化學(xué)(HE染色)結(jié)果顯示,與對照組相比,I1WL5W能使MRKP1203感染的小鼠肺組織重新恢復(fù)網(wǎng)狀的疏松結(jié)構(gòu),肺泡腔內(nèi)也變得干凈、無滲出物,細胞壁也比較完整,提示含色氨酸抗菌肽I1WL5W可以抑制炎癥因子的表達,有效治療小鼠肺部感染。
【學(xué)位單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖 1.1 抗菌肽對細菌膜作用的模型 （此圖引自 Copyright 2005 American Chemical Society）Fig. 1.1 Various models of antimicrobial peptide activity

含色氨酸抗菌肽對多藥耐藥肺炎克雷伯菌抗菌活性的研究和時間依賴的。 I4W、L12W 和 I1WL5W 在濃度為 16×MIC 時將細菌全部殺死分別需要 120 min、180 min 和 120 min。陽性對照慶大霉素在 1×MIC 的濃度時，對 MRKP120菌株的作用效果與 1×MIC 的抗菌肽的抗菌活性相似。

圖 2.2 含色氨酸系列抗菌肽對 MRKP1203 的 PAE 實驗A：I4W；B：L12W；C：I1WL5WFig.2.2 PAE of MRKP1203 treated with the Trp-containing antimicrobial peptidesA: I4W; B: L12W; C: I1WL5W2.3.4 含色氨酸系列抗菌肽對 MRKP1203 細菌形態(tài)的影響通過掃描電鏡觀察 MRKP1203 菌株在含色氨酸系列抗菌肽作用下的形態(tài)變化，實驗結(jié)果見圖 2.3。觀察實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)未經(jīng)抗菌肽作用的對照組細菌細胞膜完好無缺，菌體光滑飽滿，邊緣清晰。經(jīng)不同濃度抗菌肽作用后，細菌菌體形態(tài)發(fā)生不同程度的變化，1×MIC 時細菌表面粗糙并凹陷，2×MIC 作用時，菌體表面破裂，有大量的內(nèi)容物泄露出來；并且相同濃度下，不同抗菌肽對 MRKP1203 菌株的作用效果也不完全相同，抗菌肽 I1WL5W 比 I4W 和 L12W 對 MRKP1203 菌株的作用效果更強。本實驗中，經(jīng)三種含色氨酸抗菌肽作用后，細菌表面形態(tài)發(fā)生不同程度的變化，說明抗菌肽破壞細菌細胞膜，使細菌內(nèi)部的物質(zhì)向外泄漏，從而導(dǎo)致細菌死亡。
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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬艷軍;含色氨酸系列抗菌肽對多藥耐藥肺炎克雷伯菌MRKP1203抗菌活性的研究[D];遼寧師范大學(xué);2019年

本文編號：2877687