少突膠質細胞(oligodendrocyte,OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中的成髓鞘細胞,由少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)分化而來。髓鞘的形成不僅為神經(jīng)元間高速快捷的電信號傳導所必須,還為軸突提供營養(yǎng)支持,保護軸突完整性。OL對多種內(nèi)外環(huán)境的損傷因素敏感,易發(fā)生細胞損傷、功能失調(diào)甚至凋亡,導致嚴重的脫髓鞘疾病,甚至精神疾病,如:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)、精神分裂癥等。髓鞘損傷的修復依賴于OPC,這些細胞均勻分布于CNS,且維持前體細胞的特征,可在損傷情況下增殖,并分化為成熟OL,修復受損的髓鞘,即髓鞘再生(Remyelination)。但由于細胞微環(huán)境中的抑制性信號分子等原因,OPC分化常常受到抑制,而不能完成髓鞘再生。因此,研究促進OPC分化和髓鞘再生對于CNS脫髓鞘疾病的治療方法有著重要的科學意義。其中,發(fā)現(xiàn)能促進OPC分化和髓鞘修復再生的藥物或藥物靶點也是神經(jīng)科學基礎和臨床研究關注的重要科學難題之一。篩選能促進OPC分化的藥物或化合物是促進髓鞘再生治療最直接的方法之一。傳統(tǒng)方法利用細胞培養(yǎng),逐一篩查藥物其對OPC分化的影響。該方法的弊端是過程耗時耗力,而且效果也難以同其他藥物或化合物相比較,進行優(yōu)中選優(yōu)。為了滿足對挖掘藥物的高效、高質量的要求,有必要建立一種新的篩選方法。最新的高通量篩選技術是篩選并挖掘有效藥物及化合物作用及其機制的有效方法。其中,二元指示髓鞘化納米微柱陣列(Binary Indicant for myelination using Micropillar Arrays,BIMA)技術,可以實現(xiàn)對髓鞘形成藥物的大批量篩選。且高通量技術(如RNA微陣列)能為我們提供更多、更完整的關于具體生物過程的基因表達信息,幫助我們更好的理解生物過程背后的作用機制。通過與國外實驗室合作,我們成功建立了該篩選體系。本研究中,我們應用BIMA系統(tǒng)篩選了大量藥物和化合物。發(fā)現(xiàn)非典型性抗精神病藥喹硫平(quetiapine,QUE)是其中的一種有力的選藥物,能有效促進OPC分化和髓鞘再生。我們進一步以QUE作為工具藥,利用微陣列技術檢測了QUE作用后,OPC分化的基因表達譜改變及基因本體學變化特點,發(fā)現(xiàn)染色質重塑復合體相關基因可能在OPC分化中發(fā)揮了重要作用。而近年來研究表明,表觀遺傳調(diào)控,尤其以Brg1為代表的染色質重塑分子在OPC分化中扮演了重要的角色。為此,我們制備了少突膠質細胞系特異性轉基因小鼠,對微陣列分析中發(fā)現(xiàn)的,可能在OPC分化中發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用的分子,染色質重塑分子BAF155的作用進行了初步的探討。此外,我們也對BIMA系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)的廣譜藥物—阿司匹林是否可促進OPC分化和髓鞘形成,以及其作用機制進行了研究。主要結果如下:(1)利用BIMA系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)可能促進OPC分化的候選藥物利用最新發(fā)現(xiàn)的高通量髓鞘形成篩選BIMA系統(tǒng)。我們對藥物/化合物庫中200種化合物進行篩查,發(fā)現(xiàn)了一系列能促進分化OPC分化的藥物。通過免疫熒光染色和Western Blot等技術,我們對氯馬斯汀、U50488和QUE等幾種能顯著促進OPC的分化的藥物進行了初步的細胞學效應驗證。其中我們主要感興趣的是,本實驗室前期研究一直關注的藥物,非典型性抗精神藥喹硫平QUE。(2)QUE促進OPC分化和髓鞘再生通過免疫熒光染色和Western Blot,我們發(fā)現(xiàn),QUE處理后,不僅能促進培養(yǎng)OPC分化成熟,也顯著提高了新生大鼠胼胝體區(qū)MBP的表達,促進髓鞘形成。而在Cuprizone脫髓鞘模型中,QUE能有效促進髓鞘再生,表明QUE是有力的候選藥物,可作為研究促進OPC分化和髓鞘再生機制及藥物靶點的工具藥。(3)微陣列篩查發(fā)現(xiàn)染色質重塑蛋白BAF155參與OPC分化利用微陣列技術,以QUE為工具藥,我們研究了其作用機制。首先通過OPC正常分化過程中微陣列檢測出的差異基因,我們明確了該技術能夠更全面地反應OPC分化過程中的基因變化和重要的信號通路。通過檢測與OPC正常分化相比較,QUE處理后出現(xiàn)顯著上調(diào)/下調(diào)的基因聚類發(fā)現(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)QUE處理后,染色質重塑復合體相關基因出現(xiàn)明顯下調(diào),與其促進OPC分化重要密切相關,通過對相關基因具體分析,我們發(fā)現(xiàn)BAF155變化最為顯著,可能是調(diào)控OPC分化的關鍵候選分子。(4)BAF155對調(diào)控OPC的分化具有重要作用我們設計并制備了BAF155 flox小鼠。通過與PDGFaRCreERT小鼠雜交,成功獲得可在少突膠質前體細胞特異性敲除BAF155小鼠(BAF155~(flox/flox),PDGFaRCre+/+)。在發(fā)育過程中使用他莫昔芬誘導特異性敲除OPCs中的BAF155。利用免疫熒光和原位雜交等技術檢測了BAF155對OPC發(fā)育分化的作用,我們的結果表明,在OPC中敲除BAF155后,成熟OL標志物MBP和MAG表達下降,說明BAF155在OPC分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其詳細機制還需要進一步研究。(5)發(fā)現(xiàn)和鑒定阿司匹林促進OPC分化和髓鞘形成的新作用利用培養(yǎng)的OPC,我們發(fā)現(xiàn):阿司匹林處理后,培養(yǎng)OPC中Ki67和PDGFaR雙標染色(即增殖OPC)細胞數(shù)沒有明顯改變,而OL成熟標志物MBP陽性細胞數(shù)明顯增高,細胞形態(tài)上也表現(xiàn)出成熟OL的特性;新生大鼠腦白質發(fā)育模型中,阿司匹林處理后MBP表達明顯增強,表明阿司匹林可促進OPC分化好髓鞘形成。進一步研究發(fā)現(xiàn),阿司匹林處理后,Wnt/β-catenin信號通路中的重要信號分子,GSK-3表達水平明顯升高,其下游靶向因子β-catenin磷酸化水平升高,而GSK3β磷酸化水平下降;用QS11,一種選擇性的Wnt/β-catenin信號通路激動劑處理OPC后,OPC分化受到了明顯抑制,而阿司匹林處理能拮抗QS11的作用。以上結果表明,阿司匹林可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路,促進OPC的分化。綜上所述,為了發(fā)現(xiàn)促進OPC分化和髓鞘形成的藥物靶點,我們利用BIMA系統(tǒng)及微陣列等高通量篩選技術,發(fā)現(xiàn)QUE是一種有效促進OPC分化和髓鞘再生的候選藥物,并以QUE為工具藥,發(fā)現(xiàn)了染色質重塑復合體相關分子BAF155在OPC分化中的重要調(diào)控作用。同時,我們也發(fā)現(xiàn)并闡明了阿司匹林通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路促進OPC分化的作用途徑。以上研究為我們進一步挖掘促進OPC分化和髓鞘再生藥物的新途徑和新靶點提供了新的思路。
【學位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：
陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文 個復雜的過程，單純加少量外來物質（1μM）不足以外，BIMA 篩選出的藥物或化合物在增殖和分化的作用進增殖要么促進分化，這個結果符合增殖和分化在生物結果證明了我們建立的 BIMA 高通量篩選體系的有效
24圖 2-3 BIMA 檢測促進 OPC 分化的代表性藥物示意及效果統(tǒng)計。A. BIMA 檢測結果免疫熒光掃描圖示意（紅色熒光標記為 PDGFaR，用于標記 OPC 細胞，綠色熒光標記為 MBP，用于標記成熟 OL）。B. 量化統(tǒng)計免疫熒光掃描圖檢測結果，數(shù)據(jù)按平均數(shù)（+）標準差形式展示。*與未給予藥物處理組對比，p <0.05。
圖 2-4 免疫熒光染色驗證 BIMA 篩選出的藥物效果。A. 培養(yǎng) OPC，加入 QUE，U50488 或氯馬斯汀處理后 6 天時免疫熒光檢測結果（紅色熒光標記為 PDGFaR，用于標記 OPC 細胞，綠色熒光標記為 MBP，用于標記成熟 OL，以下相同）。B. 量化統(tǒng)計藥物處理后陽性 MBP 和 PDGFaR 細胞數(shù)，反映了細胞分化情況。數(shù)據(jù)按平均數(shù)（+）標準差形式展示。**與未給予 QUE 組對比，p <0.01。2.3.3 QUE 促進 CNS 髓鞘發(fā)育和再生為明確 QUE 是否能促進 CNS 髓鞘發(fā)育，我們對新生 3 天大鼠給予 QUE 灌胃處理，于 7 天和 14 天后取材，免疫熒光染色結果表明，QUE 處理后，大腦中胼胝體區(qū) MBP明顯增多，Western Blot 結果也反映了相同趨勢（圖 2-5）。以上結果表明，QUE 能有效促進 OPC 分化和髓鞘形成�？紤]到髓鞘再生對藥物治療少突膠質細胞相關疾病的重要性，我們檢測了 QUE 在髓鞘再生中的作用。首先，我們按之前本實驗室方法建立了經(jīng)典的 Cuprizone 脫髓鞘模型，喂食 Cuprizone 6 周后中止，結束脫髓鞘的同時，給予 QUE（10mg/kg/天）處理。治療 2 周后，用免疫組化的方法檢測胼胝體區(qū) MBP 表達，結果表明，相比對照組，QUE
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2894132
