發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 18:28

　　 肝素(heparin,HP)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)與葡萄糖胺(glucosamine,GlcN)構(gòu)成的二糖單元組成的一種糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),其中二糖單元的不同位點(diǎn)存在不同程度的硫酸化修飾,導(dǎo)致肝素結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。肝素是臨床上重要的抗凝藥物,臨床實(shí)踐還發(fā)現(xiàn)肝素能明顯延長(zhǎng)癌癥患者的生存期,藥理活性研究進(jìn)一步證明肝素及其衍生物在動(dòng)物體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,其主要機(jī)制是阻斷腫瘤細(xì)胞黏附、抑制新生血管生成等。但動(dòng)物源肝素存在較大的安全隱患,而且化學(xué)法脫硫酸化、乙�；�修飾可能導(dǎo)致肝素衍生物的工藝可靠性差、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。因此,迫切需要發(fā)展一種更加安全、可靠的制備肝素及其衍生物的新方法。大腸桿菌K5(Escherichia coli K5)產(chǎn)生的莢膜多糖是一種非硫酸化的GAG,二糖重復(fù)單元由GlcA與乙酰葡萄糖胺(acetyl glucosamine,GlcNAc)組成,因而被稱為肝素前體(heparosan或N-acetylheparosan,NAH)。本課題通過發(fā)酵大腸桿菌K5制備肝素前體heparosan;然后采用化學(xué)處理與酶催化反應(yīng)相結(jié)合的策略對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾,以合成不同硫酸化修飾模式的肝素衍生物;最后測(cè)定得到的五種肝素衍生物體外對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影響,揭示肝素衍生物抑制腫瘤細(xì)胞黏附的構(gòu)效關(guān)系,為研究非動(dòng)物源抗腫瘤肝素類創(chuàng)新藥物提供參考依據(jù)。本學(xué)位論文取得的成果及結(jié)論包括以下幾個(gè)方面:1.Heparosan多糖的制備與表征大腸桿菌K5在葡萄糖合成培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵18 h,發(fā)酵上清液經(jīng)超濾濃縮、醇沉得胞外多糖粗品,粗品經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱層析純化得多糖精品,以每升發(fā)酵液制備的多糖純品計(jì),產(chǎn)量為105 mg/L。雙糖分析與核磁共振(NMR)測(cè)試表明制備的細(xì)菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)與肝素前體heparosan相同;凝膠滲透色譜(GPC)分析表明heparosan的純度為98.2%,分子量為69.22 kDa,制備規(guī)模達(dá)到克級(jí)。2.非動(dòng)物源肝素衍生物的制備與結(jié)構(gòu)表征Heparosan在堿性條件下徹底N-脫乙�；�,其后以三氧化硫-三甲胺復(fù)合物為硫酸基供體進(jìn)行N-硫酸化(NS)修飾得到含N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的肝素衍生物(命名為NS-NAH),其肝素酶完全水解產(chǎn)物的雙糖分析確定不飽和雙糖△U-GlcNS的比例為97.9%,說明絕大多數(shù)GlcNAc被修飾為GlcNS。在C5異構(gòu)化酶(Cs-epi)和2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(2-OST)的共同催化下,NS-NAH的GlcA殘基一步轉(zhuǎn)變?yōu)?-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),經(jīng)QSepharose強(qiáng)陰離子交換柱層析純化得到含IdoA2S的肝素衍生物(命名為I2S-NS-NAH),雙糖分析證明其雙糖△U2S-GlcNAc、AU2S-GlcNS 的含量 0.7%、90.4%,表明 GlcA 的轉(zhuǎn)化率超過90%。在6-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶1和6-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶3(6-OST1/3)的催化下,I2S-NS-NAH 的 GlcN(GlcNS 及 GlcNAc)殘基被 6-O-硫酸化(6S),離子交換柱層析純化得到含GlcNS6S、GlcNAc6S的肝素衍生物(命名為6S-12S-NS-NAH),雙糖分析表明其雙糖 △U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S 和AU2S-GlcNS6S 的含量為 0.5%、13.5%、66.4%,表明 GlcN 的 6S 修飾率80%。NS-NAH經(jīng)6-OST1/3兩酶的催化修飾、離子交換柱層析純化得到另一種6S修飾的肝素衍生物(命名為6S-NS-NAH),雙糖分析確定其雙糖△U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S含量為0.4%、87.4%,表明GlcN的6S修飾率達(dá)87.8%。此外,將6S-I-2S-NS-NAH 溶于 0.5M NaOH 并于-20℃靜置 3d、凍干使 IdoA2S 發(fā)生 2-0-脫硫酸化,得到含IdoA的產(chǎn)物(命名為6S-I-NS-NAH),雙糖分析表明90.5%的IdoA2S發(fā)生2-0-脫硫酸化。NMR鑒定了五種肝素衍生物的結(jié)構(gòu)特征;GPC純度分析表明除6S-I-NS-NAH外,其余四種肝素衍生物的純度均達(dá)90%;衍生物的制備規(guī)模均達(dá)到百毫克級(jí)。3.肝素衍生物的抗凝活性及對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附的影響運(yùn)用抗FXa試劑盒測(cè)定heparosan及五種肝素衍生物的抗凝活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)全部樣品的效價(jià)均不到對(duì)照品肝素鈉的1%,因此合成的產(chǎn)物為非抗凝肝素衍生物。參考文獻(xiàn)從新生兒臍帶中提取HUVECs并采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果表明,濃度2000μg/ml的heparosan及五種肝素衍生物對(duì)HUVECs與腫瘤細(xì)胞均無明顯的細(xì)胞毒性(P0.05)。濃度為200μg/ml的五種肝素衍生物均對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10展現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性(P0.05),而heparosan則不能;對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,只有6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH展現(xiàn)出細(xì)胞毒性(P0.05);而對(duì)HUVECs,只有I2S-NS-NAH表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒性(P0.05)。腫瘤細(xì)胞黏附HUVECs實(shí)驗(yàn)證實(shí),在測(cè)試的低、中、高三個(gè)濃度下(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml),heparosan和NS-NAH均沒有表現(xiàn)出明顯的抗黏附作用;12S-NS-NAH在高濃度下能抑制B16-F10黏附HUVECs作用,而中、高濃度的6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH、6S-NS-NAH均展現(xiàn)出抗黏附作用,對(duì)照品肝素鈉在低中高濃度下均展現(xiàn)出抗黏附作用。中濃度的6S-12S-NS-NAH具有明顯的抗黏附作用(P0.05),I2S-NS-NAH 則沒有(P0.05);6S-NS-NAH 在中、高濃度下均具明顯的抗黏附作用(P0.05),而NS-NAH均無作用(P0.05),因此,6-O-硫酸化對(duì)肝素衍生物的抗黏附作用是非常關(guān)鍵的。不同濃度的6S-I2S-NS-NAH與6S-I-NS-NAH相比,抗黏附作用沒有顯著差異(P0.05),提示IdoA的2-O-硫酸化對(duì)抗黏附作用沒有顯著影響。此外,6S-NS-NAH與6S-I-NS-NAH的抗黏附作用也沒有顯著差異(P0.05),二者主要區(qū)別在于糖醛酸的不同,說明GlcA與IdoA對(duì)肝素衍生物的抗黏附作用影響不大。與其他衍生物比較,以heparosan為原料合成肝素衍生物6S-NS-NAH的工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高,值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

而后再培養(yǎng)１８－２４ｈ，發(fā)酵液離心并收集菌體沉淀，菌體于冰上超聲破碎，??離心，上清液過濾后用ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ親和柱層析（１．５ｃｍ＞＜１５ｃｍ）進(jìn)行純化，??上樣后先用Ａ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣｌ、３０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）充分洗脫以??除去雜蛋白，然后再用Ｂ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣＩ、２５０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）??洗脫目的蛋白，向目的蛋白溶液中加入１５％－２０％的甘油，－８０°Ｃ凍存?zhèn)溆谩??３．結(jié)果與分析??３．?１?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的提取與純化??發(fā)酵液經(jīng)醇沉得到的ｈｅｐａｒｏｓａｎ含有蛋白質(zhì)、色素、鹽等雜質(zhì)，為一種粗品。??運(yùn)用Ｑ?Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ強(qiáng)陰離子交換柱純化可將ｈｅｐａｒｏｓａｎ與雜質(zhì)分離，如圖２－１，中??間只有２１０?ｎｍ吸收而沒有２６０?ｎｍ和２８０?ｎｍ吸收的峰即為ｈｅｐａｒｏｓａｎ的純化峰。??經(jīng)計(jì)算，以純化后凍干的ｈｅｐａｒｏｓａｎ純品計(jì)，每升發(fā)酵液產(chǎn)量約為１０５?ｍｇ。??３３Ｋ，??３３００－?＊??

３．?２?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的表征??Ｈｅｐａｒｏｓａｎ經(jīng)肝素酶ｍ切割后進(jìn)行ＨＰＬＣ分析，與肝素雙糖標(biāo)準(zhǔn)品的ＨＰＬＣ??圖譜（如圖２－２）比較，ｈｅｐａｒｏｓａｎ多糖全部被切成雙糖ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ?（如圖２－３），??這表明ｈｅｐａｒｏｓａｎ的雙糖重復(fù)單元為－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃ－。同時(shí)由Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的１Ｈ?ＮＭＲ??圖譜可清楚看到ＧｌｃＮＡｃ的異頭氫（５５．２９）、Ｎ－乙�；�的氫信號(hào)峰（Ｓ１．９４）和??ＧｌｃＡ的異頭氫（５４．４０），如圖２－４。因此，發(fā)酵純化后制備的ｈｅｐａｒｏｓａｎ結(jié)構(gòu)特??征與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)相符。ＧＰＣ分析結(jié)果顯示，１４．７?ｍｉｎ處出現(xiàn)單一對(duì)稱峰，如??圖２－５，因此經(jīng)醇沉與強(qiáng)陰離子交換柱層析純化后的ｈｅｐａｒｏｓａｎ純度達(dá)９８．１９％。??以多角度激光散射（ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，?ＭＡＬＬＳ）測(cè)定?ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的??重均分子量為６９．２２?ｋＤａ，多分散指數(shù)（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ?ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）?１．５６，如圖??２－６?〇??０．０６－｜?６??Ｅ?３?５?８?１?ＡＵ－ＧＩｃＮＡｃ??１２?２?ＡＵ－ＧＩｃＮＳ??Ｃｇ?０．０４－?４?３?ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ??苑?

圖２－６?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的多角度激光散射圖譜（見實(shí)驗(yàn)記錄本ＩＩＩ－ｐｌｌ）??Ｆｉｇ．２－６?Ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ｈｅｐａｒｏｓａｎ??４討論??大腸桿菌Ｋ５經(jīng)搖瓶發(fā)酵，兩步純化得到ｈｅｐａｒｏｓａｎ，產(chǎn)量約１０５?ｍｇ／Ｌ，但??與文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)量還有一定差距［２９］。通過進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件和純化步驟，尤其運(yùn)??３０??
【參考文獻(xiàn)】

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3 張治云;凌沛學(xué);王鳳山;張?zhí)烀?;低分子肝素臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國生化藥物雜志;2006年04期

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本文編號(hào)：2893417