研究背景:隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,藥物治療已成為醫(yī)療活動(dòng)中最重要的、最常見的手段,每年有數(shù)以千萬的兒童在接受藥物治療。藥物治療給患病兒童帶來福音,保護(hù)他們的健康,提高他們的生命質(zhì)量;同時(shí)也帶來一些不良反應(yīng),尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面的副作用;嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng)常常使病人面臨降低藥物劑量甚至停藥的困境,同時(shí)對(duì)病人的心理、生理、和生活質(zhì)量都可能產(chǎn)生損害。在過去幾十年里,科學(xué)家們?yōu)榱颂骄克幬锔弊饔脤?duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的毒性機(jī)制,進(jìn)行了大量的研究,但是進(jìn)展非常緩慢。因此,研究藥物神經(jīng)毒性的作用機(jī)制,已是迫在眉睫的任務(wù)。利血平(Reserpine)在臨床上被廣泛使用于高血壓與精神分裂癥的治療;其主要藥理作用機(jī)制是通過限制特異性單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體(Monoamine vesicle transporter VMAT)阻礙神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入囊泡造成突觸末端多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的消耗。臨床觀察和研究發(fā)現(xiàn)利血平存在導(dǎo)致抑郁樣和帕金森樣癥狀的副作用。已有研究表明高濃度利血平對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CNS產(chǎn)生影響,包括在行為上運(yùn)動(dòng)減緩以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平的降低;利血平可以抑制多巴胺能神經(jīng)元的生長和發(fā)育,減少大鼠黑質(zhì)致密部酪氨酸輕化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)細(xì)胞的數(shù)量。在CNS內(nèi),多巴胺能神經(jīng)元分布于端腦、間腦、腦干和脊髓,形成四個(gè)主要的投射通路,行使不同的功能。TH作為催化兒茶酚胺生物合成的限速酶,被廣泛使用于多巴胺系統(tǒng)表達(dá)的標(biāo)記物。有研究表明調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的糖蛋白Wnt家族在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中會(huì)出現(xiàn)差異性表達(dá)。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Midbrain astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)抵御神經(jīng)毒性損害中發(fā)揮著重要作用。此外,Otpa與Otpb則是與多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)。微小RNA5(microRNAs,miRs)是一類高度保守性、非編碼RNA,通過與內(nèi)源mRNA堿基配對(duì)抑制靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。數(shù)以百計(jì)的miRs在哺乳動(dòng)物的大腦中表達(dá),并參與到各種各樣的功能中。miRs與神經(jīng)退化和精神疾病的病因?qū)W和病理生理學(xué)均密切有關(guān)。miRs對(duì)CNS的正常發(fā)育和生理活動(dòng)以及藥物的神經(jīng)毒性均具有重要的調(diào)節(jié)作用。miRs的固有特點(diǎn)使其成為調(diào)控神經(jīng)元應(yīng)激的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。不同疾病的miRs表達(dá)模式不同說明不同致病機(jī)制導(dǎo)致的神經(jīng)元損害可以表現(xiàn)在特異性的miRs變化上。miRs幾乎在調(diào)節(jié)所有細(xì)胞過程中發(fā)揮積極作用。探索潛在的miRs靶基因,臨床應(yīng)用可能會(huì)取得更大進(jìn)展。miR-129存在于小鼠、人類、大鼠、斑馬魚等物種體內(nèi)。miR-129是通過miR-129-1和miR-129-2這兩種基因轉(zhuǎn)錄而生成,miR-129家族由miR-129-1和miR-129-2組成;miR-129-1-3p和miR-129-2-3p兩者之間只有一個(gè)堿基差異,幾乎不可能從功能上區(qū)別,統(tǒng)稱為miR-129-3p。利用miRBase數(shù)據(jù)庫查閱不同物種miR-129的序列,發(fā)現(xiàn)miR-129在不同物種中具有高度保守性,有研究表明miR-129調(diào)控一系列與癌癥的診斷和治療以及其它生理過程密切相關(guān)的基因,由此可見mtiR-129參與調(diào)控各項(xiàng)重要的生理活動(dòng)。已有研究證實(shí)miR-129-3p在斑馬魚胚胎的腦部大量表達(dá)。據(jù)此我們推測miR-129-3p在斑馬魚大腦神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著某種重要的角色。然而,miR-129-3p對(duì)認(rèn)知功能的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。斑馬魚體型纖細(xì),繁殖能力很強(qiáng),養(yǎng)殖成本低。更重要的是,斑馬魚基因組與人類基因組相似度達(dá)87%,這意味著在其身上做實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。斑馬魚是擁有脊椎動(dòng)物保守的神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)造和豐富的行為模式,幼齡斑馬魚其腦部透明、結(jié)構(gòu)簡單,成為探究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和藥物神經(jīng)毒性發(fā)病機(jī)制的理想模型。因此本研究選擇斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討胚胎期利血平暴露對(duì)胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響及可能的分子機(jī)制。rcan2是一種甲狀腺激素的應(yīng)答基因,也是鈣依賴磷酸酶的調(diào)控基因。rcan2在小鼠大腦內(nèi)特異性高表達(dá),此外在心肌和骨骼肌中也有分布。rcan2蛋白與唐氏綜合癥、心臟肥大癥和阿爾茲海默癥等疾病病理學(xué)相關(guān)。rcan2蛋白主要通過結(jié)合并運(yùn)輸Ca2+和絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶來行使功能�；罨疶細(xì)胞核因子是它的底物,可介導(dǎo)一系列重要信號(hào)通路的調(diào)控,包括神經(jīng)元發(fā)育。有研究表明rcan2的敲除降低了小鼠的進(jìn)食量,導(dǎo)致小鼠體重的減輕、脂肪含量的減少和運(yùn)動(dòng)量的輕微減弱。經(jīng)過Targetscan數(shù)據(jù)庫的比對(duì),發(fā)現(xiàn)miR-129-3p與rcan2基因擁有潛在的結(jié)合位點(diǎn),推測miR-129-3p可能調(diào)控rcan2的表達(dá)。為了明確利血平神經(jīng)毒性作用,miR-129-3p對(duì)斑馬魚胚胎CNS的影響,以及與rcan2的相關(guān)性。本研究設(shè)計(jì)兩部分實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行:(1)利血平在斑馬魚胚胎中的神經(jīng)毒性研究;(2)miR-129-3p通過rcan2拮抗利血平誘導(dǎo)的斑馬魚神經(jīng)毒性研究。第一部分利血平在斑馬魚胚胎中的神經(jīng)毒性研究目的:通過對(duì)利血平處理后斑馬魚胚胎的研究,探究其對(duì)斑馬魚早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的毒性作用。方法:行為學(xué)監(jiān)測利血平處理后斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)功能變化,以及利血平處理后斑馬魚胚胎對(duì)光與聲音刺激的敏感性改變;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Liquid chromatography-mass spectrometer LC-MS)技術(shù)檢測利血平處理后斑馬魚胚胎多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的各神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化;qRT-PCR檢測利血平處理后對(duì)斑馬魚胚胎多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)情況的影響;原位雜交技術(shù)檢測利血平處理后斑馬魚胚胎大腦視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量改變情況。結(jié)果:不同濃度利血平處理后斑馬魚胚胎在光照或黑暗情況下均出現(xiàn)平均游動(dòng)距離顯著性降低,平均游行速度明顯減緩;利血平處理后斑馬魚胚胎對(duì)外界光或聲音刺激敏感性下降,平均游動(dòng)距離降低,平均游行速度減緩,刺激出現(xiàn)時(shí)反應(yīng)減弱;并且發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量水平,包括多巴胺,5-輕色胺與去甲腎上腺素,在經(jīng)過利血平浸泡的斑馬魚胚胎中較對(duì)照組明顯下降,而5-羥色胺代謝產(chǎn)物含量沒有發(fā)生明顯變化。同時(shí),利血平處理后的斑馬魚胚胎大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組減少。而與多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因,包括otpa,otpb,wnt1,wnt3,wnt5和manf在利血平處理組中均表現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:利血平藥物對(duì)斑馬魚早期神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,對(duì)其發(fā)育和功能產(chǎn)生影響,包括運(yùn)動(dòng)功能受損、對(duì)外界刺激敏感性降低、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少;斑馬魚大腦中多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)損傷以及相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)成功建立斑馬魚帕金森樣模型,為今后藥物對(duì)中樞神經(jīng)毒性的研究,做出很好的嘗試,并打下良好基礎(chǔ)。第二部分miR-129-3p通過rcan2拮抗利血平誘導(dǎo)的斑馬魚神經(jīng)毒性研究。目的:通過對(duì)miR-129-3p在斑馬魚體內(nèi)功能的研究,探究其對(duì)斑馬魚胚胎機(jī)體和早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控作用,以及miR-129-3p介導(dǎo)的rcan2拮抗利血平的神經(jīng)毒性研究。方法:qRT-PCR檢測miR-129-3p在斑馬魚胚胎和成魚體內(nèi)的表達(dá)譜;顯微注射miR-129-3p類似物和morpholino以高表達(dá)和敲降斑馬魚胚胎體內(nèi)miR-129-3p的表達(dá)水平;免疫熒光法檢測高表達(dá)或敲降miR-129-3p后對(duì)斑馬魚胚胎頭部細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響;原位雜交檢測敲降miR-129-3p后斑馬魚胚胎大腦內(nèi)視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量改變情況;行為學(xué)檢測利血平處理顯微注射miR-129-3p類似物的斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)功能變化;qRT-PCR檢測利血平處理后斑馬魚胚胎miR-129-3p表達(dá)情況;原位雜交技術(shù)檢測利血平處理顯微注射miR-129-3p類似物后斑馬魚胚胎大腦內(nèi)視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量改變情況;qRT-PCR檢測高表達(dá)或敲降miR-129-3p后對(duì)rcan2表達(dá)情況的影響。結(jié)果:隨著斑馬魚胚胎的發(fā)育,miR-129-3p的表達(dá)水平隨之升高;miR-129-3p在成年斑馬魚的腦部大量表達(dá);高濃度miR-129-3p的敲降會(huì)造成斑馬魚胚胎發(fā)育畸形,而miR-129-3p的高表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎行為學(xué)發(fā)生變化;miR-129-3p的敲降會(huì)引起斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡的增加;敲降miR-129-3p的斑馬魚胚胎大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組減少,而高表達(dá)miR-129-3p可部分挽救由利血平造成的斑馬魚行為減緩以及大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少。利血平處理后導(dǎo)致斑馬魚胚胎miR-129-3p水平下調(diào)。此外,miR-129-3p的敲降還導(dǎo)致了r an2的表達(dá)水平上升,而miR-129-3p高表達(dá)則引起了rcan2表達(dá)水平的下降。結(jié)論:miR-129-3p對(duì)斑馬魚的胚胎機(jī)體和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。miR-129-3p的降低會(huì)造成斑馬魚大腦中多巴胺能神經(jīng)元受損。利血平處理后斑馬魚miR-129-3p水平降低。miR-129-3p的高表達(dá)可挽救由利血平暴露引起的多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育功能損傷。rcan2是miR-129-3p調(diào)控的一種潛在的靶基因。本實(shí)驗(yàn)為研究藥物神經(jīng)毒性的發(fā)生機(jī)制和防治措施提供新的思路。兩部分整體結(jié)論:使用利血平藥物將導(dǎo)致斑馬魚大腦中多巴胺能神經(jīng)元的損傷;miR-129-3p對(duì)斑馬魚的胚胎機(jī)體和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要;miR-129-3p的降低會(huì)造成斑馬魚大腦中多巴胺能神經(jīng)元受損;利血平導(dǎo)致斑馬魚胚胎miR-129-3p水平降低。高表達(dá)miR-129-3p對(duì)利血平誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)損害具有保護(hù)作用;rcan2可能是miR-129-3p調(diào)控的一個(gè)潛在的靶基因。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：
ＲＩＳＣ）的一部分，它通過與靶ｍＲＮＡ?３ＴＪＴＲ完全或不完全的互補(bǔ)堪合，導(dǎo)致靶??ｍＲＮＡ的降解或翻譯的抑制，通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控ＤＮＡ甲基化與組蛋白修飾，??從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡（圖１－１）?（３０－３２）。一個(gè)??ｍｉＲ可以耙向多個(gè)ｍＲＮＡ，相反，一個(gè)ｍＲＮＡ可以被多個(gè)ｍｉＲｓ耙向。ｍｉＲｓ??幾乎在調(diào)節(jié)所有細(xì)胞過程發(fā)揮積極作用，包括分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化??（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）、增殖、凋亡、遷移和血管生成等。探??索潛在的ｍｉＲｓ祀基因，臨床應(yīng)用可能會(huì)取得更大進(jìn)展。ｍｉＲｓ可以對(duì)其目標(biāo)基因??的表達(dá)進(jìn)行微調(diào)，超過２５００個(gè)ｍｉＲｓ被標(biāo)注在人類基因組中，超過６０％的人類??蛋白質(zhì)基因被預(yù)測為ｍｉＲｓ的靶點(diǎn)。??１７??
調(diào)控各項(xiàng)重荽的生理活動(dòng)。ｍｉＲ－１２９擁有其特定的組織特異性表達(dá)模式，主要在??生物體的腦部表達(dá)，已有研宄者證實(shí)其在斑馬魚胚胎的腦部和原腎中大量表達(dá)??（
圖５?ｍｉＲ－１２９－３ｐ高表達(dá)后斑馬魚胚胎（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）行Ｆｉｇ．５?Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｚｅｂｒａ?ｆｉｓｈ?ｅｍｂｒｙｏ（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）?ａｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｍｉＲ－１２９－３ｐ??２４ｈｆ４８ｈｆ７２ｈｆ??
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2893192
