發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 23:18

　　 研究背景與目的法米替尼是我國(guó)自主研發(fā)的1.1類新藥,也是一個(gè)多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑,對(duì)多種實(shí)體瘤均有較好的療效。然而,在其臨床應(yīng)用中仍存在著以下問(wèn)題:(1)臨床前實(shí)驗(yàn)表明法米替尼對(duì)中國(guó)非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者突變率較高的驅(qū)動(dòng)基因表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)無(wú)抑制效果,而臨床試驗(yàn)顯示其對(duì)EGFR野生型的患者有較好的療效,表明法米替尼的抗腫瘤機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步驗(yàn)證;(2)法米替尼對(duì)轉(zhuǎn)移性腎癌有較好的療效,但臨床上尚未找到與腎癌治療相關(guān)的特異性較強(qiáng)的生物標(biāo)志物,仍需對(duì)法米替尼的臨床效應(yīng)相關(guān)因素進(jìn)行探索。綜上,進(jìn)一步探索法米替尼的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制,對(duì)推動(dòng)法米替尼個(gè)體化用藥具有重要意義。本課題組前期基于激酶酶譜篩查平臺(tái),檢測(cè)了法米替尼對(duì)275個(gè)蛋白激酶的抑制率,并結(jié)合各激酶在腫瘤中的意義,初步確定了棘皮動(dòng)物微管結(jié)合樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(Echinoderm microtubule-associated protein-like4-Anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因的突變蛋白為其潛在靶點(diǎn)。因此,本課題將具有該遺傳背景的NSCLC細(xì)胞株NCI-H2228為主要研究對(duì)象,在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平對(duì)該靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證,并初步闡明法米替尼作用機(jī)制。此外,本研究還將檢測(cè)臨床患者的血藥濃度,綜合臨床基本信息考察法米替尼療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性因素,為法米替尼的個(gè)體化給藥提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果1.以克唑替尼為陽(yáng)性對(duì)照藥,用CCK-8(Cell counting kit-8)法檢測(cè)法米替尼對(duì)NCI-H2228細(xì)胞的增殖抑制活性,同時(shí)考察法米替尼對(duì)該細(xì)胞凋亡、周期和遷移的影響。結(jié)果顯示,法米替尼對(duì)EML4-ALK融合基因突變的NSCLC細(xì)胞具有較好的活性抑制作用,且20nM法米替尼處理48 h后的NCI-H2228細(xì)胞與空白對(duì)照組相比,能使NCI-H2228細(xì)胞凋亡率顯著增加且周期阻滯在G0/G1期,同時(shí)法米替尼還能抑制其遷移,提示法米替尼具有抑制EML4-ALK突變的NSCLC增殖及促進(jìn)凋亡的能力。2.分別用不同濃度法米替尼(5,10,20nM)處理NCI-H2228細(xì)胞48h后,采用免疫印跡法(Western blotting,WB)分析細(xì)胞中ALK及其下游蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示,法米替尼能夠顯著抑制ALK及其下游蛋白的磷酸化并促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)且呈劑量依賴性,提示法米替尼抑制NCI-H2228細(xì)胞活性可能與ALK/Akt/ERK/STAT3通路抑制有關(guān)。3.采用裸鼠皮下接種NCI-H2228細(xì)胞,建立體內(nèi)相應(yīng)的荷瘤模型,以克唑替尼(100mg/kg·d)為陽(yáng)性對(duì)照,觀察給藥后不同劑量下法米替尼組(2.5,5,10,20mg/kg·d)的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,克唑替尼和法米替尼中高劑量均能顯著性地抑制腫瘤生長(zhǎng)(P0.01),表明法米替尼也可能對(duì)EML4-ALK突變的NSCLC生長(zhǎng)具有良好的抑制作用,且呈劑量依賴的趨勢(shì)。但后期克唑替尼和法米替尼均產(chǎn)生耐藥情況,高劑量組法米替尼的效果優(yōu)于克唑替尼,表明后期仍需進(jìn)一步開(kāi)展法米替尼對(duì)EML4-ALK二次突變耐藥的相關(guān)研究。4.建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass,UHPLC-MS/MS)方法同時(shí)檢測(cè)人體血漿中法米替尼原型及主要代謝產(chǎn)物(M3、M7、M9-1和M9-5)并對(duì)臨床晚期腎癌的患者進(jìn)行血藥濃度檢測(cè),結(jié)合臨床患者的基本信息,療效及不良反應(yīng)發(fā)生情況進(jìn)行法米替尼療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性分析,結(jié)果表明法米替尼原型(M0)的血藥濃度與患者的獲益率相關(guān)(P0.05),法米替尼代謝產(chǎn)物M3的血藥濃度與與轉(zhuǎn)移灶累及器官數(shù)相關(guān)(P0.05),法米替尼代謝產(chǎn)物M9-1與手足綜合征的發(fā)生率相關(guān)(P0.05)。結(jié)論首次發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了法米替尼在細(xì)胞水平對(duì)EML4-ALK融合基因突變的NSCLC細(xì)胞具有顯著的抑制作用,初步闡明了法米替尼抑制EML4-ALK突變的NSCLC細(xì)胞的可能作用機(jī)制,即抑制ALK/Akt/ERK/STAT3腫瘤調(diào)控通路。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了法米替尼對(duì)其活性的抑制效果,后期還可圍繞法米替尼開(kāi)展EML4-ALK二次突變導(dǎo)致耐藥的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)中所建立的UHPLC-MS/MS方法可成功應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè),并對(duì)晚期腎癌患者進(jìn)行了血藥濃度的檢測(cè),首次將其與療效及不良反應(yīng)進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明法米替尼原型及代謝產(chǎn)物可能與療效及不良反應(yīng)發(fā)生率相關(guān),但后期仍需進(jìn)一步考察驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

學(xué)碩士學(xué)位論文異性分析性分析通過(guò) SPSS 21.0 進(jìn)行處理，對(duì)凋亡率的比較采用 t 檢驗(yàn)，P＜0.著性差異，P＜0.01 時(shí)認(rèn)為有非常顯著差異。、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果） IC50值分析算（圖 1-1），法米替尼與克唑替尼對(duì) NCI-H2228 腫瘤細(xì)胞的 IC50值 和 26.8 nM，說(shuō)明法米替尼對(duì) EML4-ALK 突變的細(xì)胞也有較好的抑

圖 1-2. 法米替尼對(duì) NCI-H2228 細(xì)胞凋亡的抑制作用（n=3）左圖為給藥后細(xì)胞凋亡數(shù),其中右上、右下象限分別為后期凋亡和早期凋亡細(xì)胞比例；右圖法米替尼處理 48h 后細(xì)胞的凋亡率**比 P＜0.01（VS 空白對(duì)照組）（三） 法米替尼對(duì) NCI-H2228 細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法米替尼對(duì) NCI-H2228 細(xì)胞的周期影響，結(jié)果見(jiàn)圖 1-3。從圖中可以看出，經(jīng)法米替尼處理后，細(xì)胞周期變化比較顯著，與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升（P<0.05），比例高達(dá) 72.38%，G2 期細(xì)胞則顯著下降（P<0.01），比例僅為 1.2%，說(shuō)明 NCI-H2228 細(xì)胞被法米替尼阻滯在 G0/G1 期。（四） 法米替尼對(duì) NCI-H2228 細(xì)胞遷移能力的影響通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法米替尼處理后 NCI-H2228 細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果見(jiàn)圖

圖 1-3 法米替尼對(duì) NCI-H2228 細(xì)胞周期的影響（n=3）左圖為給藥后細(xì)胞周期測(cè)定原始數(shù)據(jù)，右圖為給藥后的細(xì)胞周期分布情況，**P＜0.01（VS 空白對(duì)照組）
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