黃斑水腫(Macular edema,ME)作為視網(wǎng)膜疾病中心視力損害的主要原因,是臨床迫切需要治療的眼病之一。然而,目前黃斑水腫的治療主要依賴于格柵樣激光光凝、玻璃體腔內(nèi)注藥、球后/球周注射等有創(chuàng)治療手段,這些治療不但伴隨有術(shù)后盲點(diǎn)、玻璃體腔出血、眼內(nèi)炎等多種并發(fā)癥的發(fā)生,而且患者依從性較低。因此,尋求一種安全、有效的黃斑水腫的治療方案,是目前眼科領(lǐng)域亟待解決的問題之一。點(diǎn)眼具有簡(jiǎn)單易行、易于存儲(chǔ)、副作用少等優(yōu)點(diǎn),是一種理想的、可選擇的給藥途徑。但傳統(tǒng)滴眼液生物利用度低,點(diǎn)眼后因淚液沖刷和鼻淚管外排等多種清除機(jī)制及眼部屏障的存在,只有1-10%或者更少的藥物到達(dá)眼前節(jié),無(wú)法或更少一部分藥物到達(dá)眼后節(jié)。近年來(lái),納米遞藥系統(tǒng)如脂質(zhì)體、納米粒、納米乳等在眼科領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注,并成為促進(jìn)藥物向眼后節(jié)有效遞送的希望。以往研究證實(shí),脂質(zhì)體(liposome)因具有角膜穿透性好、生物相容性強(qiáng)、無(wú)毒、緩釋、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),更適宜于眼科領(lǐng)域的應(yīng)用。然而,普通脂質(zhì)體由于存在包封率低、生物利用度低等問題很難將有效藥物濃度遞送至眼后節(jié)。因此,探索并設(shè)計(jì)一種新的眼部遞藥系統(tǒng),能將藥物有效遞送至眼后節(jié),并克服普通脂質(zhì)體低包封率、低生物利用度的問題,是目前該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。醋酸鈣梯度法(calcium acetate gradient)通過形成膜內(nèi)外離子梯度,可大大提高藥物包封率,因此,本實(shí)驗(yàn)嘗試采用醋酸鈣梯度法制備脂質(zhì)體以求克服普通脂質(zhì)體低包封率的問題。殼聚糖(chitosan,CH)作為一種具有陽(yáng)離子特性的天然生物材料,對(duì)眼表吸附性強(qiáng)、滯留時(shí)間長(zhǎng),故而可增加藥物與眼表作用以提高生物利用度。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖作為表面修飾,以增加眼表粘附性及角膜滲透性,從而克服普通脂質(zhì)體生物利用度低的問題。曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)TA具有抗炎、抗新生血管生成、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等特性,同時(shí)還可以減輕細(xì)胞的免疫反應(yīng)、穩(wěn)定血房水及血視網(wǎng)膜屏障、阻止成纖維細(xì)胞的化生、抑制上皮細(xì)胞的增生等。但由于曲安奈德為脂溶性藥物,溶解度低,大大限制了其在眼科的應(yīng)用。本研究旨在建立并評(píng)估一種新型、高效的曲安奈德納米遞藥系統(tǒng),通過點(diǎn)眼的方式,將藥物遞送至眼后節(jié)并發(fā)揮作用。因此,本課題以曲安奈德為模型藥物,以脂質(zhì)體為載體,殼聚糖為表面修飾,成功制備出曲安奈德殼聚糖脂質(zhì)體(triamcinolone acetonide chitosan-coated liposomes,TA-CHL)滴眼液。通過電鏡觀察、粒徑分布、表面電位測(cè)定、包封率測(cè)定、差示掃描量熱法、體外釋放、穩(wěn)定性等對(duì)TA-CHL的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步考察;利用光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)(optical coherence tomography system,OCT)、人角膜上皮細(xì)胞(Human corneal epithelial cells,HCEC)和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells,ARPE-19)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)以及通過建立糖尿病性視網(wǎng)膜水腫大鼠模型,從藥效學(xué)角度對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步探究;通過監(jiān)測(cè)眼壓變化、蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)和TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)法(TdT-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL)對(duì)脂質(zhì)體點(diǎn)眼后大鼠的眼部安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。本研究以脂質(zhì)體包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),考察不同制備工藝對(duì)曲安奈德殼聚糖脂質(zhì)體包封率的影響,重點(diǎn)對(duì)制備方法、有機(jī)溶劑種類的選擇、孵化溫度、孵化時(shí)間、探頭超聲時(shí)間、探頭超聲功率、旋蒸時(shí)間、水合溫度、醋酸鈣濃度、膽固醇:卵磷脂之比、藥脂比等因素進(jìn)行了考察,采用正交設(shè)計(jì)篩選出最優(yōu)處方和制備工藝,具體為:采用醋酸鈣梯度法,醋酸鈣濃度120 mmol/1,藥脂比為1:15,膽固醇:卵磷脂為1:8,孵化溫度為37 ℃,孵化時(shí)間60 min,探頭超聲功率為90 w,探頭超聲時(shí)間5 min,旋蒸時(shí)間為30 min,水合溫度50℃。由上述優(yōu)化條件下制備所得TA-CHL制劑為白色略帶乳光的膠體溶液,電鏡下呈大小均勻、表面被覆一層欠光滑包膜的圓形囊性顆粒,其分散好,無(wú)粘連和聚集;粒徑為135.46 ± 4.49 nm,Zeta電位為17.98 ± 3.21 mv,包封率為90.66 ± 3.21%;差示掃描量熱法結(jié)果提示TA-CHL中曲安奈德在328.27℃的吸收峰消失,表明TA被成功包裹進(jìn)了 TA-CHL中,不再以晶體結(jié)構(gòu)形式存在;體外釋放實(shí)驗(yàn)提示TA-CHL中TA的釋放持久、緩慢,約70%TA從TA-CHL釋放需24 h,具有顯著緩釋作用;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TA-CHL在冷藏4℃保存30 d和60 d均穩(wěn)定好。為從藥效學(xué)角度評(píng)價(jià)CHL作為藥物載體對(duì)眼前后節(jié)的遞送效率,特制備熒光香豆素6脂質(zhì)體(Coumarin-6 liposomes,C6-liposomes)和香豆素6殼聚糖脂質(zhì)體(Coumarin-6 chitosan-coated liposomes,C6-CHL),OCT動(dòng)態(tài)觀察給予BN大鼠點(diǎn)眼后不同時(shí)間點(diǎn)眼前、后節(jié)藥物的分布情況,比較不同時(shí)間點(diǎn)藥物分布的相對(duì)熒光密度(relative intensity of fluorescence)。結(jié)果顯示,CHL、liposomes兩種載體均可將藥物遞送至眼后節(jié),但相比而言,CHL的遞送效能要優(yōu)于普通liposomes的遞送效能,其生物利用度更高。通過HCEC和ARPE-19細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),利用熒光顯微鏡分別觀察細(xì)胞孵育5 min、10 min、15 min、30 min、240 min后,HCEC及ARPE-19細(xì)胞對(duì)C6-CHL、C6-liposomes的攝取情況,結(jié)果顯示,在以上不同時(shí)間點(diǎn)C6-liposomes和C6-CHL均能夠被HCEC和ARPE-19細(xì)胞攝取,且兩種細(xì)胞對(duì)C6-CHL的攝取能力優(yōu)于對(duì)C6-liposomes的攝取。此外,本課題通過建立糖尿病性視網(wǎng)膜水腫大鼠模型,給予大鼠TA-CHL和TA-liposome滴眼液點(diǎn)眼后,HE染色和電鏡觀察,結(jié)果表明,兩組大鼠視網(wǎng)膜水腫情況較前減輕,且TA-CHL對(duì)視網(wǎng)膜水腫的改善程度要優(yōu)于TA-liposomes對(duì)視網(wǎng)膜水腫的改善程度;而普通曲安奈德溶液點(diǎn)眼后視網(wǎng)膜水腫程度無(wú)改善。因此,以上結(jié)果均表明,CHL能成功將曲安奈德有效遞送至眼后節(jié)并發(fā)揮作用,是一種比普通脂質(zhì)體生物利用度更高的眼部遞藥系統(tǒng)。通過監(jiān)測(cè)眼壓變化、HE染色及TUNEL檢測(cè)對(duì)TA-CHL滴眼液點(diǎn)眼后眼部安全性進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,給予大鼠TA-CHL滴眼液點(diǎn)眼后15天、30天、90天后眼壓與點(diǎn)眼前相比,眼壓變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HE染色結(jié)果示TA-CHL點(diǎn)眼后結(jié)膜、角膜組織均無(wú)明顯水腫、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);TUNEL檢測(cè)結(jié)果示TA-CHL點(diǎn)眼后均無(wú)明顯TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的增多,視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡小體數(shù)量沒有增加。以上結(jié)果表明,TA-CHL滴眼液點(diǎn)眼后無(wú)眼壓升高、無(wú)眼部刺激性及毒副作用的發(fā)生,是一種安全性好的新型滴眼劑型。本課題設(shè)計(jì)并證實(shí)了新型眼藥水制劑TA-CHL滴眼液能有效將曲安奈德遞送至眼后節(jié)并發(fā)揮其作用,克服了普通脂質(zhì)體低包封率、低生物利用度的問題,是一種新型、高效、安全的用于治療視網(wǎng)膜水腫的眼藥水制劑。因此,本課題的研究為曲安奈德的臨床應(yīng)用提供了一種有效、安全的新劑型,為不同原因所致黃斑水腫的治療提供了新途徑和新方向。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R96
【部分圖文】：
１．１?ＴＡ檢測(cè)波長(zhǎng)及含量測(cè)定方法的建立??１．１．１檢測(cè)波長(zhǎng)的確定??由所得紫外吸收?qǐng)D譜圖１－１和圖１－２可見，ＴＡ在２４０?ｎｍ處有峰值吸收，??而空白輔料在峰值２４０?ｎｍ處略有吸收。因此推知，若選用紫外分光光度計(jì)對(duì)??ＴＡ進(jìn)行含量的測(cè)定，空白輔料在峰值處的吸收，必將對(duì)ＴＡ含量的測(cè)定會(huì)造成??一定的干擾。顯然，本實(shí)驗(yàn)選用紫光分光光度計(jì)測(cè)量ＴＡ的含量是不可行的。??因此，本實(shí)驗(yàn)特選擇高效液相色譜法（ｈｉｇｈ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，??ＨＰＬＣ）對(duì)曲安奈德進(jìn)行含量的測(cè)定。??：．．．．．Ｉ．．．．．．｜．．．．．．｜．．．．．．Ｉ．．．．．．：．．．．．．：—；—：．．．．．．?－??＿?／ｉｌ?ｉ?丨?ｉ?Ｖｔｉｌ－１．．．．．．�。椋簦簦�??＾?！?！?！?８５?�。埽停颍�?Ｍ?Ｍ?！??！?！?ｉ?！?ｙ；！�。�！?Ｍ?！?ｉ?！?Ｉ??〇—………〇ｉ—??－ｌｌ?ｉ?ｉ?：??－ｉｌ：?：：：：：：�。�??２００?３００?４００?５００?６００?２００?３００?４００?５００?６００?７００?８００?９００?１０００?１１００??波長(zhǎng)（ｎｍ）?波長(zhǎng)（ｎｍ）??圖１－１曲安奈德樣品溶液的紫外光譜?圖１－２空內(nèi)輔料的紫外光譜??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ＴＡ?Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?ａｄｊｕｖａｎｔ??１．２方法學(xué)??１．２．１專屬性??按“１．２色譜條件”得到三種樣品色譜圖見圖２－１、２－２、２－３。由色譜圖
１．１?ＴＡ檢測(cè)波長(zhǎng)及含量測(cè)定方法的建立??１．１．１檢測(cè)波長(zhǎng)的確定??由所得紫外吸收?qǐng)D譜圖１－１和圖１－２可見，ＴＡ在２４０?ｎｍ處有峰值吸收，??而空白輔料在峰值２４０?ｎｍ處略有吸收。因此推知，若選用紫外分光光度計(jì)對(duì)??ＴＡ進(jìn)行含量的測(cè)定，空白輔料在峰值處的吸收，必將對(duì)ＴＡ含量的測(cè)定會(huì)造成??一定的干擾。顯然，本實(shí)驗(yàn)選用紫光分光光度計(jì)測(cè)量ＴＡ的含量是不可行的。??因此，本實(shí)驗(yàn)特選擇高效液相色譜法（ｈｉｇｈ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，??ＨＰＬＣ）對(duì)曲安奈德進(jìn)行含量的測(cè)定。??：．．．．．Ｉ．．．．．．｜．．．．．．｜．．．．．．Ｉ．．．．．．：．．．．．．：—；—：．．．．．．?－??＿?／ｉｌ?ｉ?丨?ｉ?Ｖｔｉｌ－１．．．．．．�。椋簦簦�??＾?！?！?！?８５?�。埽停颍�?Ｍ?Ｍ?！??！?！?ｉ?！?ｙ；�。。�！?Ｍ?！?ｉ?！?Ｉ??〇—………〇ｉ—??－ｌｌ?ｉ?ｉ?：??－ｉｌ：?：：：：：：�。�??２００?３００?４００?５００?６００?２００?３００?４００?５００?６００?７００?８００?９００?１０００?１１００??波長(zhǎng)（ｎｍ）?波長(zhǎng)（ｎｍ）??圖１－１曲安奈德樣品溶液的紫外光譜?圖１－２空內(nèi)輔料的紫外光譜??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ＴＡ?Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?ａｄｊｕｖａｎｔ??１．２方法學(xué)??１．２．１專屬性??按“１．２色譜條件”得到三種樣品色譜圖見圖２－１、２－２、２－３。由色譜圖
輔料的HPLC色譜圖
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本文編號(hào)：
2880234
