葛根素對順鉑誘導小鼠耳毒性的防護作用研究

發(fā)布時間：2020-11-11 20:58

　　目的研究葛根素對順鉑誘導小鼠耳毒性的防護作用及其機制,為臨床防治順鉑所致耳聾提供新思路。方法1、在體實驗100只成年BALB/c小鼠隨機分為四組:對照組、順鉑組、順鉑+葛根素組和葛根素組(n=25只)。順鉑組腹腔注射順鉑4.5mg/kg/d,連續(xù)5d;葛根素組腹腔注射葛根素200mg/kg/d,連續(xù)14d;順鉑+葛根素組先提前腹腔注射葛根素200mg/kg/d,連續(xù)9d,在第10d同時腹腔注射順鉑4.5mg/kg/d,連續(xù)5d;對照組則腹腔注射等量生理鹽水。應用聽腦干反應(auditory brainstem response,ABR)測試和耳蝸毛細胞計數(shù),觀察小鼠用藥前后的聽力變化和毛細胞損傷情況;應用免疫熒光染色、蛋白免疫印跡(Western blot)和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)等技術(shù)檢測耳蝸內(nèi)基質(zhì)交感分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)、Orai1、瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1)、鈣蛋白酶2(calpain2)的表達。2、離體實驗取新生3d BALB/c小鼠耳蝸基底膜,于無血清的新鮮培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)24h后,棄去原培養(yǎng)基。將基底膜隨機分為4組,對照組給予新鮮無血清培養(yǎng)基2ml;順鉑組給予含有順鉑(16μg/ml)的新鮮無血清培養(yǎng)基2ml;順鉑+葛根素組提前給予10~(-6)M葛根素無血清新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后,加入順鉑(16μg/ml)至2ml;葛根素組給予10~(-6)M葛根素無血清新鮮培養(yǎng)基2ml;各組在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)標記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法,觀察耳蝸毛細胞形態(tài)變化,并統(tǒng)計各組毛細胞數(shù)量。應用Western blot技術(shù)檢測耳蝸毛細胞內(nèi)STIM1和Orai1蛋白的表達;采用Ca~(2+)熒光探針Fluo-4 AM負載入毛細胞,激光共聚焦顯微鏡來觀察各組耳蝸毛細胞內(nèi)游離Ca~(2+)水平。結(jié)果1.連續(xù)給藥后,順鉑組ABR閾移與對照組相比明顯增大(P0.01);順鉑+葛根素組ABR閾移與順鉑組相比明顯減小(P0.01);葛根素組ABR閾移與對照組相比無顯著性差異(P0.05)。2.在體小鼠耳蝸和離體培養(yǎng)基底膜的毛細胞計數(shù)結(jié)果均顯示,順鉑組外毛細胞缺失率與對照組相比顯著增大(P0.01);與順鉑組相比,在體實驗中順鉑+葛根素組耳蝸基底膜的底回和中回的外毛細胞缺失率明顯減少(P0.01);離體實驗中順鉑+葛根素組與順鉑組相比,外毛細胞和內(nèi)毛細胞缺失均顯著減少(P0.01);對照組與葛根素組相比,差異不顯著(P0.05)。3.細胞內(nèi)Ca~(2+)水平檢測結(jié)果顯示,順鉑組耳蝸毛細胞內(nèi)的Ca~(2+)水平明顯高于對照組(P0.01);而順鉑+葛根素組耳蝸毛細胞內(nèi)Ca~(2+)水平與順鉑組相比顯著減弱(P0.01);對照組與葛根素組相比熒光強度無明顯差異(P0.05)。4.Real-time PCR結(jié)果顯示,順鉑組STIM1和Orai1的mRNA水平明顯高于對照組(P0.01);而順鉑+葛根素組STIM1和Orai1的mRNA水平與順鉑組相比明顯降低(P0.05,P0.01);葛根素組的STIM1和Orai1的mRNA表達與對照組相比無明顯變化(P0.05)。5.免疫熒光鋪片結(jié)果表明,順鉑組STIM1、Orai1的陽性反應與對照組相比顯著增強(P0.01);順鉑+葛根素組STIM1、Orai1的陽性反應與順鉑組相比明顯減弱(P0.01);對照組與葛根素組相比無顯著性差異(P0.05)。6.在體與離體實驗的Western blot檢測結(jié)果均表明,順鉑組的STIM1、Orai1表達與對照組相比均明顯增強(P0.01);順鉑+葛根素組的蛋白表達與順鉑組相比明顯減弱(P0.05);葛根素組與對照組相比蛋白表達并無明顯變化(P0.05)。7.免疫熒光檢測結(jié)果顯示,順鉑組TRPV1和calpain2蛋白陽性表達明顯強于對照組(P0.01);順鉑+葛根素組與順鉑組相比陽性表達明顯減弱(P0.01);而對照組與葛根素組的熒光強度相比無明顯變化(P0.05)。結(jié)論葛根素可通過減少STIM1、Orai1、TRPV1和calpain2蛋白表達,抑制耳蝸細胞發(fā)生鈣超載,從而有效防護順鉑所致小鼠聽功能受損。
【學位單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R979.1;R764.43
【部分圖文】：

耳蝸毛細胞,離體,順鉑,葛根素

組別外毛細胞缺失率（%）底回中回頂回對照組 3.00±1.10 3.30±1.00 2.40±2.80順鉑組 75.70±3.70**40.30±5.90**19.50±3.00*順鉑+葛根素組 36.20±4.20**△△24.00±5.10**△△16.40±2.80*葛根素組 4.30±1.00 4.00±2.70 3.10±1.80注：**與對照組比較，P＜0.01；△△與順鉑組比較，P＜0.01（三）離體耳蝸毛細胞計數(shù)結(jié)果顯示，順鉑組耳蝸毛細胞出現(xiàn)明顯的倒伏和缺失，且損傷數(shù)量明顯多照組（P＜0.01）；順鉑+葛根素組與對照組相比毛細胞仍有缺失（P01），但與順鉑組相比毛細胞損傷數(shù)量減少（P＜0.01）；對照組與葛根素較無明顯差異（P＞0.05）（圖 1-1，圖 1-2）。

底膜,順鉑,毛細胞,對照組

注：**與對照組比較，P＜0.01；△△與順鉑組比較，P＜0.01素對順鉑致毒離體耳蝸毛細胞內(nèi) Ca2+水平的影示，TRITC-鬼筆環(huán)肽標記的毛細胞纖毛呈紅色熒光，F(xiàn)lu Ca2+顯示為綠色熒光。順鉑組毛細胞內(nèi)的 Ca2+水平與對＜0.01）；順鉑+葛根素組毛細胞的 Ca2+水平與對照組相比與順鉑組相比明顯降低（P＜0.01）；對照組毛細胞的 C無明顯變化（P＞0.05）（圖 2-1，圖 2-2）。

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