發(fā)布時(shí)間：2018-07-13 08:55

【摘要】：順鉑(Cisplatin, CP)是目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一,其抑癌作用與劑量成正比。但其在正常組織中的毒副作用,包括神經(jīng)毒性、耳毒性、腎毒性等,尤其是腎毒性,一定程度上限制了順鉑的應(yīng)用。近年來(lái)研究表明,順鉑通過(guò)激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷、凋亡以及壞死,其信號(hào)通路包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙。但目前對(duì)順鉑腎毒性確切細(xì)胞內(nèi)信號(hào)及其機(jī)制尚未完全闡明。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress, ERS)是指異常的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)正常折疊,導(dǎo)致未折疊蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂,最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂。多種腎臟疾病中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,如膜性腎病、先天性腎病綜合征、缺血性腎小管損傷等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在順鉑腎損傷中的作用亦有報(bào)道。如順鉑處理腎小管細(xì)胞可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)表達(dá)上調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡分子caspase-12活化。 Sigma-1受體分子(sigma-1receptor, Sig-1R)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的伴侶分子,位于線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondrion-associated ER membrane, MAM)上。 Sig-1R主要通過(guò)穩(wěn)定MAM上三磷酸肌醇受體(inositol trisphosphate receptor,IP3R),調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),保護(hù)細(xì)胞活性。研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞,激活Sig-1R能夠抑制缺血引起的Ca2+失衡,減輕細(xì)胞缺血性損傷。在大鼠肝臟缺血再灌注模型中,特異性配體激活Sig-1R后,可減輕肝臟缺血再灌注損傷。siRNA干擾人晶狀體細(xì)胞Sig-1R后,caspase-3活性增加。過(guò)表達(dá)Sig-1R能明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,增加細(xì)胞活性。因此,我們?cè)O(shè)想,Sig-1R可通過(guò)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。 線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”,是合成ATP、電子傳遞和氧化磷酸化的主要場(chǎng)所。線粒體功能障礙在腎損傷中的作用已得到廣泛關(guān)注。在多種腎臟疾病模型中,均存在線粒體形態(tài)異常,并伴隨線粒體DNA突變、線粒體DNA拷貝數(shù)下降以及細(xì)胞凋亡。業(yè)已證明,線粒體功能障礙亦參與順鉑誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞損傷。順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多、激活促凋亡蛋白如Bax.Bak,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的兩個(gè)細(xì)胞器,它們?cè)诠δ芘c結(jié)構(gòu)上都存在密切聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的交聯(lián)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+平衡、傳遞凋亡信號(hào)等功能�，F(xiàn)認(rèn)為,線粒體內(nèi)的Ca2+濃度與線粒體ATP合成、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)的開(kāi)放密切相關(guān)。Sig-1R通過(guò)穩(wěn)定IP3R參與線粒體Ca2+濃度調(diào)節(jié)。因此我們進(jìn)一步推測(cè),Sig-1R通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+平衡,阻斷腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙,保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞。第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙參與順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及線粒體功能障礙在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞,復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)并根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用不同劑量的順鉑(0、5、10、20μmol/L)刺激不同時(shí)間(0、6、12、24、48h)。采用real-time PCR檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein94,GRP94)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促凋亡分子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷貝數(shù)的表達(dá)；western blot檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞上皮性鈣粘素(epithelial cadherin,E-cadherin)的表達(dá)；Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；熒光探針Fluo-3/AM檢測(cè)胞漿Ca2+濃度；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性；熒光探針DCHFDA染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成；JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。 結(jié)果：(1)順鉑可呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡增加、上皮性鈣粘附蛋白E-cadherin表達(dá)減少。與對(duì)照組相比,順鉑刺激24小時(shí),細(xì)胞凋亡開(kāi)始增加(增加了249.7%),E-cadherin表達(dá)開(kāi)始減少(減少了38.1%)。(2)順鉑呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞胞漿Ca2+超載,順鉑呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡分子CHOP表達(dá)增加,順鉑刺激12小時(shí),GRP78、GRP94表達(dá)開(kāi)始升高(分別升高了55.2%和54.2%),順鉑刺激24小時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡分子CHOP表達(dá)開(kāi)始增加(增加了118.7%),提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)間早于腎小管上皮細(xì)膪損傷的發(fā)生時(shí)間。(3)順鉑呈劑量誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加,順鉑呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位下降mtDNA拷貝數(shù)下降,順鉑刺激12小時(shí),線粒體膜電位下降、mtDNA拷貝數(shù)開(kāi)始下降(分別下降了33.0%和29.9%),提示線粒體功能障礙發(fā)生時(shí)間早于腎小管上皮細(xì)胞損傷的發(fā)生時(shí)間。 結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙是順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的早期事件,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙參與順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。 第二部分Sig-1R通過(guò)部分阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷 目的：觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子Sig-1R對(duì)順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用。 方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1RsiRNA質(zhì)粒載體,再分別加入Cisplatin (10μmol/L)或生理鹽水(Saline)刺激24h。Sig-1R過(guò)表達(dá)分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R過(guò)表達(dá)、Cisplatin+Sig-1R過(guò)表達(dá)；Sig-1R干擾分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R干擾組、Cisplatin+Sig-1R干擾組。應(yīng)用real-time PCR法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促凋亡分子CHOP的表達(dá)；western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、 Sig-1R、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡分子CHOP、caspase-12的蛋白表達(dá)；Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞儀和Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；熒光探針Fluo-3/AM檢測(cè)胞漿Ca2+濃度；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性；caspase-3的底物檢測(cè)其活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備Sig-1R過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,隨機(jī)分為4組：WT Saline組、WT Cisplatin組、Sig-1R transgenic Saline組、Sig-1R transgenic Cisplatin組。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)構(gòu)建順鉑急性腎損傷小鼠模型,同時(shí)對(duì)照組腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h處死小鼠,檢測(cè)尿蛋白/肌酐、血肌酐、血尿素氮水平；HE和PAS染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變；檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞損傷及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)。 結(jié)果：(1)腎小管上皮細(xì)胞體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Sig-1R siRNA后,其Sig-1R mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下降。(2)Sig-1R siRNA轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞后再加入Cisplatin刺激,較未轉(zhuǎn)染Sig-1R siRNA的Cisplatin組,細(xì)胞活性下降35.2%(P0.05),細(xì)胞凋亡增加80.4%(P0.05)、caspase-3活化增加,E-cadherin表達(dá)減少,胞漿Ca2+濃度升高,(GRP78、GRP94、CHOP表達(dá)增加,caspase-12活化增加。(3)腎小管上皮細(xì)胞體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Sig-1R過(guò)表達(dá)Sig-1R, Real-time PCR和western blot結(jié)果顯示：腎小管上皮細(xì)胞Sig-1R mlRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高。(4)與Cisplatin組相比較,過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷,過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低、細(xì)胞凋亡增加、E-cadherin表達(dá)下調(diào)、caspase-3活化增加。同時(shí),Sig-1R過(guò)表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)Cisplatin誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞胞漿Ca2+超載、GRP78、GRP94、CHOP表達(dá)上調(diào)、caspase-12活化增加。(5)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sig-1R transgenic Cisplatin組小鼠較WT Cisplatin組,小鼠尿蛋白/肌、血肌酐和血尿素氮濃度分別降低67.7%、51.7%和75.4%(均P0.05)、NGAL、IL-18表達(dá)分別下降65.9%和37.4%(均P0.05)、細(xì)胞凋亡減少、CHOP表達(dá)下降、caspase-12活化減少,提示小鼠過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的急性腎損傷和腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。 結(jié)論：Sig-1R通過(guò)部分阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷。 第三部分Sig-1R通過(guò)部分阻斷線粒體功能障礙減輕順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷 目的：觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子Sig-1R對(duì)順鉑(Cisplatin)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1R siRNA質(zhì)粒載體,再分別力入Cisplatin (10μmol/L)或生理鹽水(Saline)刺激24h。Sig-1R過(guò)表達(dá)分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R過(guò)表達(dá)、Cisplatin+Sig-1R過(guò)表達(dá)；Sig-1R干擾分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R干擾組、Cisplatin+Sig-1R干擾組。應(yīng)用real-time PCR和、western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor-y coactivator-la, PGC-la)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mitochondrial transcription factor A, TFAM)的表達(dá)；熒光探針鈣黃綠素/AM檢測(cè)細(xì)胞MPTP孔開(kāi)放情況；real-time PCR法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)；熒光探針DCHFDA染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況；JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備Sig-1R過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,隨機(jī)分為4組：WT Saline組、WT Cisplatin組、Sig-1R transgenic Saline組、Sig-1Rtransgenic Cisplain組。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)構(gòu)建順鉑急性腎損傷小鼠模型,同時(shí)對(duì)照組腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h處死小鼠,檢測(cè)線粒體功能障礙的相關(guān)指標(biāo)。 結(jié)果：(1)與Cisplatin組相比,Cisplatin+Sig-1R干擾組TFAM、PGC-1α表達(dá)分別下降49.7%和42.3%(均P0.05), ROS產(chǎn)生增加27.9%(P0.05), mtDNA拷貝數(shù)及線粒體膜電位分別下降17.5%和29.3%(均P0.05), MPTP孔開(kāi)放增加。(2)過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙,過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的TFAM、PGC-1α表達(dá)下降、mtDNA拷貝數(shù)及線粒體膜電位下降、ROS產(chǎn)生增加、MPTP孔開(kāi)放。(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導(dǎo)的TFAM、PGC-1α表達(dá)下降、ntDNA拷貝數(shù)下降,提示Sig-1R過(guò)表達(dá)可部分抑制Cisplatin誘導(dǎo)的腎皮質(zhì)線粒體功能障礙。 結(jié)論：Sig-1R通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,部分阻斷線粒體功能障礙,從而減輕順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 蘇維維;丁桂霞;朱春華;袁楊剛;張愛(ài)華;黃松明;;Sig-1R基因表達(dá)抑制對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和足細(xì)胞損傷的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年05期

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本文編號(hào)：2118837