發(fā)布時間：2020-12-13 07:31

　　目的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin Receptor,TfR,CD71）介導(dǎo)細胞對鐵的吸收,對細胞增殖具有重要意義。生理情況下,TfR在細胞表面低表達,而腫瘤細胞鐵代謝發(fā)生改變,對鐵的攝入增加,故TfR表達水平大幅上調(diào)。本研究旨在構(gòu)建并生產(chǎn)出靶向TfR的雙特異性抗體,并通過體外細胞系實驗與臨床樣本實驗,驗證其活化T細胞并靶向殺傷腫瘤細胞的作用,為TfR作為腫瘤治療靶點奠定基礎(chǔ)。方法1.構(gòu)建表達載體Single-TfR-CD3-His并轉(zhuǎn)染DG44細胞,挑選出蛋白表達量較高的細胞株大規(guī)模培養(yǎng),用鎳離子親和層析法純化出目的抗體并鑒定。2.體外細胞系實驗流式檢測TfR-BiTE介導(dǎo)T細胞對多種不同細胞來源的血液腫瘤細胞的殺傷情況。3.收集臨床白血病患者血樣,并檢測腫瘤細胞TfR表達水平,流式檢測TfR-BiTE介導(dǎo)T細胞對原代白血病細胞的殺傷效果。結(jié)果1.純化出TfR-BiTE共約0.8ml,濃度為2.17mg/ml,抗體分子量約55kDa。2.血液腫瘤均高表達TfR,TfR-BiTE介導(dǎo)T細胞對血液各腫瘤細胞系均有不錯的殺傷效果:對AML細胞系KG-1a最大殺傷率達到約40%,對淋巴... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

TfR一Bi下〔分別與相應(yīng)靶點結(jié)合

分析上圖發(fā)現(xiàn)：TfR-BiTE 可以介導(dǎo) PBMCs 對多種血液腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作，殺傷效果與 TfR-BiTE 濃度成正比，濃度低至 1ng/ml 時即可觀察到殺傷效果。 步分析發(fā)現(xiàn)，不同細胞來源的腫瘤細胞對 TfR-BiTE 介導(dǎo)的 PBMCs 殺傷效應(yīng)敏感性不同，KG-1a 的最大死亡率為 40%左右，而兩種淋巴細胞來源的腫瘤細死亡率較高，尤其是 B 細胞來源的 U266，達到 80%的殺傷率。急性髓細胞白血細胞似乎對TfR-BiTE介導(dǎo)的PBMCs殺傷腫瘤細胞效果有 定的抵抗，TfR-BiTE導(dǎo)的 PBMCs 對 K562 和 HL-60 兩種急性髓細胞白血病細胞系的殺傷效果甚至還遜于對 KG-1a 的殺傷效果。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，MIX 組的死亡率總是要高出 MED，說明 CD3mAb 對 T 細胞有 定的活化作用，而這部分活化的 T 細胞也有 定殺傷效果，但這種程度的活化和對腫瘤細胞的殺傷效果與 TfR-BiTE 相比顯得不足道。TfR-BiTE 分別介導(dǎo) PBMCs 和活化的 T 細胞殺傷腫瘤細胞系

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：活化的 T 細胞對 MOLT-4 的殺傷效果提升顯著，在效應(yīng)細胞數(shù)量減半的情況下，在抗體濃度僅為 10ng/ml 時，就達到最大殺傷效果，且最大殺傷效果比 PBMCs 的效果有所提升，說明活化的 T 細胞的確比 na ve T 細胞具有更好的殺傷效果。從結(jié)果看，活化的 T 細胞對 U266 的殺傷效果與 PBMCs 無異，可能是因為效應(yīng)細胞數(shù)量減半的原因，也可能是 U266 較敏感，PBMCs 中的 na veT 細胞就對其有明顯的殺傷效果。四、TfR-BiTE 體外殺傷原代腫瘤細胞1.白血病細胞 TfR 表達水平檢測流式細胞術(shù)檢測白血病患者骨髓血中腫瘤細胞的 TfR 表達水平，結(jié)果見圖 5和圖 6。


本文編號：2914173