成纖維細(xì)胞生長因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs),包括FGF11-FGF14,是一類新發(fā)現(xiàn)的電壓依賴性鈉通道(voltage gated sodium channel,Nav通道)結(jié)合蛋白,可通過調(diào)節(jié)Nav通道的表達(dá)和功能來調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞的興奮性。Nav通道在可興奮細(xì)胞的興奮性、傳導(dǎo)性上具有重要作用,在心臟,Nav通道異常與多種心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。如前期的研究發(fā)現(xiàn)FGF14突變或FGF12/FGF14基因敲除小鼠可引起家族遺傳性脊髓小腦運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病,我們最近的研究發(fā)現(xiàn)FGF13在鼠類心肌組織中也有明顯的表達(dá),且可調(diào)節(jié)心肌Nav通道的功能以及興奮性的傳導(dǎo),但目前并無證據(jù)證明FHFs與心律失常的發(fā)生直接相關(guān),與哪類心律失常相關(guān)。為回答此科學(xué)問題,本課題通過制備FGF13心肌條件性基因敲除小鼠動(dòng)物模型,直接在整體動(dòng)物水平檢測敲除FGF13對心肌電活動(dòng)的影響以及是否發(fā)生心律失常,并通過觀測敲除FGF13對心肌動(dòng)作電位特征以及鈉電流的影響來發(fā)現(xiàn)其可能的細(xì)胞電生理學(xué)機(jī)制,此研究將為揭示FHFs在心律失常中的作用及其機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)資料。第一部分獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠目的:(1)獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠。(2)評價(jià)此基因敲除小鼠在心肌組織中FGF13基因的敲除效果。方法:(1)應(yīng)用電轉(zhuǎn)法,southern雜交,顯微注射,移植等技術(shù)獲得F1代雜合子小鼠(FGF13-flox-neomycin)。(2)利用Flp-deleter小鼠與FGF13-flox-neomycin小鼠交配獲得去除neomycin篩選標(biāo)記基因的FGF13-flox小鼠。(3)利用myh6-Cre小鼠與FGF13-flox小鼠交配以獲得心肌表達(dá)Cre重組酶的FGF13-flox小鼠。(4)給予他莫昔芬可獲得時(shí)空調(diào)控的在心肌特異性敲除FGF13的小鼠。(5)利用實(shí)時(shí)定量PCR(q PCR)技術(shù),蛋白免疫印跡技術(shù)和細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)來評價(jià)FGF13心肌組織特異性敲除小鼠的敲除效果。結(jié)果:(1)利用Cre-Lox P基因打靶原理,首先制備了FGF13-flox-neomycin F1代雜合子小鼠,然后將其與Flp-deleter小鼠交配以去除neomycin標(biāo)記篩選基因,最后再將得到的FGF13-flox小鼠與心肌特異性表達(dá)Cre重組酶的myh6-Cre小鼠交配獲得在心肌特異性表達(dá)Cre重組酶的FGF13-flox小鼠,此時(shí)給予他莫昔芬后即獲得時(shí)空調(diào)控的心肌組織特異性敲除FGF13的小鼠(myh6-FGF13)。(2)通過q PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)myh6-FGF13小鼠的心室肌組織中FGF13 m RNA的水平明顯降低,約為野生型的5%。(3)利用蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn),與對照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌組織的表達(dá)明顯降低。(4)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn),與對照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯降低。結(jié)論:我們成功制備FGF13-Lox P小鼠,并經(jīng)與心臟表達(dá)Cre的小鼠雜交,獲得心肌條件性敲除FGF13的基因敲除小鼠,并證明FGF13基因/蛋白在小鼠心室肌中被成功敲除,提示此基因敲除小鼠可用于后續(xù)的相關(guān)研究。第二部分利用FGF13心肌條件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其機(jī)制目的:(1)觀察FGF13是否與某種心律失常的發(fā)生有關(guān)。(2)探索FGF13引起心律失常發(fā)生的機(jī)制。方法:(1)利用整體動(dòng)物體表心電圖技術(shù)肢體二導(dǎo)聯(lián)的方式,記錄各組小鼠的心電圖,觀測敲除心肌FGF13是否有心律失常發(fā)生。(2)應(yīng)用電流鉗技術(shù)記錄小鼠心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位,觀察心肌敲除FGF13后動(dòng)作電位的變化。(3)利用電壓鉗技術(shù)檢測鈉通道電流密度及門控特征的變化。結(jié)果:(1)FGF13心肌條件性敲除小鼠心電圖QRS間期顯著延長,給予氟卡尼后可誘導(dǎo)出Brugada綜合征特有的心電圖表型。(2)FGF13心肌條件性敲除小鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位幅度明顯降低,0期除極速率明顯減慢,50%復(fù)極時(shí)間明顯延長。(3)在FGF13心肌條件性敲除小鼠心室肌細(xì)胞鈉通道電流密度顯著降低,失活曲線向超極化方向移動(dòng),激活曲線無顯著性改變。結(jié)論:FGF13心肌條件性敲除小鼠可出現(xiàn)Brugada綜合癥的特征性心電圖表型,造成此病變的原因可能與敲除FGF13后可降低心室肌鈉通道電流密度,進(jìn)而使動(dòng)作電位幅度和上升速率降低有關(guān),以上提示FGF13很可能是引起某種Brugada綜合征的致病基因。

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.7
【目錄】：

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