發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 02:22

　　 抗菌藥物是人類和動(dòng)物對(duì)抗細(xì)菌感染最重要的武器,然而由于抗菌藥物的大量不合理使用,細(xì)菌耐藥性問題已成為21世紀(jì)全球公共衛(wèi)生和食品安全最大的威脅之一。在過去的幾十年,新型抗菌藥物的研發(fā)速度遲緩,而細(xì)菌的耐藥性卻不斷出現(xiàn)。多粘菌素是治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”,由于可轉(zhuǎn)移的多粘菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn),使得多粘菌素耐藥性問題引起世界范圍的廣泛關(guān)注。目前,雖然有我國部分地區(qū)動(dòng)物源大腸桿菌mcr-1耐藥基因流行情況的研究報(bào)道,但對(duì)mcr-1在我國的流行特征和傳播機(jī)制仍缺乏了解。本研究擬在調(diào)查我國東北地區(qū)動(dòng)物源大腸桿菌中mcr-1流行情況的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步闡明mcr-1基因在動(dòng)物源大腸桿菌中的傳播機(jī)制。本研究分析了2016年6月至2016年9月從東北三省分離的豬源、雞源和奶牛源大腸桿菌mcr-1的攜帶和流行情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞源和豬源大腸桿菌的mcr-1攜帶率明顯高于奶牛源大腸桿菌的攜帶率,并顯示絕大多數(shù)mcr-1陽性分離菌對(duì)多種抗生素耐藥,特別是對(duì)四環(huán)素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星,多重耐藥性十分嚴(yán)峻。利用兩種分子分型方法探討了mcr-1陽性分離菌的分子流行特點(diǎn),結(jié)果顯示mcr-1陽性分離菌的PFGE譜型和MLST序列型具有顯著的多樣性,菌株間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析了mcr-1在分離菌中的定位情況、接合轉(zhuǎn)移能力、接合轉(zhuǎn)移頻率以及質(zhì)粒穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,mcr-1基因在質(zhì)粒和染色體上均有分布,但主要定位于大小不等的質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小在~30kb至~430kb之間,質(zhì)粒分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種不同類型的mcr-1陽性質(zhì)粒,其中以IncX4型、IncI2型和IncHI2型三種質(zhì)粒為主,接合轉(zhuǎn)移頻率范圍在1.4×10~(-6)-8.8×10~(-2)之間,穩(wěn)定性試驗(yàn)表明五種不同類型的質(zhì)粒均能穩(wěn)定存在于受體菌中。通過對(duì)分離菌基因組草圖和代表性質(zhì)粒全序列進(jìn)行測定,結(jié)果顯示本研究五種代表性質(zhì)粒與國內(nèi)報(bào)道的相應(yīng)類型質(zhì)粒序列具有較高的同源性,表明這些質(zhì)粒已在我國多個(gè)地區(qū)流行。同時(shí),通過全基因組測序分析首次發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1的毒力—耐藥雜合質(zhì)粒,推測其可能是由IncHI2型耐藥質(zhì)粒與IncF型毒力質(zhì)粒通過同源重組的方式融合而成。此外,對(duì)mcr-1基因環(huán)境研究發(fā)現(xiàn),Tn6330轉(zhuǎn)座子是介導(dǎo)mcr-1基因在不同類型質(zhì)粒間以及染色體上傳播的主要方式。對(duì)分離株中mcr-1基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的mcr-1突變體,功能研究顯示突變沒有改變MCR-1蛋白的催化活性,表明突變的兩個(gè)位點(diǎn)不是決定其功能的關(guān)鍵氨基酸殘基。本研究為揭示mcr-1在動(dòng)物源大腸桿菌中的傳播機(jī)制,為多粘菌素耐藥菌及耐藥基因轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防控提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

.1 多粘菌素的結(jié)構(gòu)多粘菌素（Polymyxin）是一組從多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）培養(yǎng)液中提肽類抗生素，其中包含多粘菌素 A、B、C、D、E 5 種組分。迄今為止，只有多粘菌素 B菌素 E（又稱粘桿菌素）應(yīng)用于臨床。多粘菌素類抗生素發(fā)現(xiàn)于 1949 年，在日本首次分，1959 年開始在歐洲、美國和中國等國家廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床和畜牧業(yè)。但由于多粘菌素窄且對(duì)腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)有較大的毒性作用，同時(shí)由于新一代療效好、毒性低的廣譜抗生素代頭孢菌素）的問世，限制了多粘菌素類藥物在人醫(yī)臨床上的使用(Li et al., 2006)。直到上 年代，隨著多重耐藥（Muti-drug resistance，MDR）和泛耐藥（Pan-drug resistance，PDR氏陰性菌，特別是耐碳青霉烯腸桿菌的出現(xiàn)，在缺乏新抗菌藥物的情況下，人們不得不重多粘菌素類藥物，將其作為治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的 最后一道防線 (Falagas11)。多粘菌素屬于陽離子多肽類抗生素，非核糖體合成，其結(jié)構(gòu)是由線性的三肽部分連接肪酰基鏈和環(huán)狀7肽構(gòu)成，4-位的L-α,γ-二氨基丁酸殘基（L-α,γ-diaminobutyric acid，L-D 10 位的 L-蘇氨酸（Thr）縮合后形成七肽環(huán)。多粘菌素 B 與多粘菌素 E 基本結(jié)構(gòu)相同，于 7 肽環(huán)上的 6-位氨基酸不同。多粘菌素 B 的 6-位氨基酸是 D-Phe，多粘菌素 E 的 6-位氨 D-Leu（圖 1.1）。

國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章其它的家族成員一樣具有相似的抗菌機(jī)制。盡管詳細(xì)的多粘菌素抗菌機(jī)理還不十分清楚認(rèn)為造成細(xì)胞膜裂解是其中重要的途徑之一。多粘菌素的抗菌機(jī)制與其兩個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)：（a）一個(gè)由 7 個(gè)氨基酸殘基組成的親水性環(huán)狀多肽 頭部 ，（b）一個(gè)長的疏水性脂 ，通過三個(gè)氨基酸殘基從 頭部 延伸出來。組成多粘菌素的十個(gè)氨基酸中六個(gè)是 L氨基丁酸殘基（L-DAB），它們都集中于親水性 頭部 ，在生理 pH 條件下，可以提電荷。多粘菌素的作用靶點(diǎn)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜上的脂多糖（Lipopolysaccharide，L多糖 （LPS）主要包括核心多糖、O-抗原和類脂 A（LipidA），其中 Lipid A 通過結(jié)合和 O-抗原以保持細(xì)胞外膜的完整性。多粘菌素發(fā)揮抗菌活性的主要驅(qū)動(dòng)力是多粘菌素膜之間的相互作用，即多粘菌素帶正電荷的陽離子 頭部 與 Lipid A 帶負(fù)電荷的陰離團(tuán)之間的靜電吸引作用。一旦與 Lipid A 結(jié)合，多粘菌素的脂類 尾部 就會(huì)穿透細(xì)胞致細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)紊亂，增加細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的物理完整性，使細(xì)胞膜失衡，造成細(xì)胞內(nèi)重要成分丟失，最終導(dǎo)致細(xì)菌裂解和死亡（圖 1.2）。

圖 1.3 雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)的多粘菌素耐藥示意圖(Baron et al., 2016)Fig. 1.3 Two-component system-mediated polymyxin resistance1 基因的發(fā)現(xiàn)究認(rèn)為，多粘菌素耐藥的產(chǎn)生是由細(xì)菌染色體突變所介導(dǎo)的，因此無法通素耐藥，因而多粘菌素耐藥菌不易形成廣泛性流行。2007 年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
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