發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 22:29

　　 流感病毒屬于正黏病毒科,是引起哺乳動(dòng)物、家禽疾病和死亡的重要病原之一。根據(jù)流感病毒NP蛋白和M蛋白的抗原差異,可以將其分為A型、B型、C型以及D型流感病毒。A型流感病毒除感染人外還能感染其它動(dòng)物,如禽、馬、豬、海豹等,B型和C型主要感染人,而D型流感病毒僅有部分牛感染病例。A型流感病毒的自然宿主是水禽,同時(shí)其對(duì)人和哺乳動(dòng)物也具有較大危害,A型流感病毒經(jīng)常以流行的形式出現(xiàn),甚至引起流感大流行,給全球經(jīng)濟(jì)以及公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅。疫苗免疫仍是防治流感病毒感染最有效的措施,但是由于流感病毒HA蛋白易于發(fā)生突變,使得每1-3年就需要更新疫苗株,給流感病毒的疫苗研制與使用推廣帶來極大的障礙。為此深入研究流感病毒的復(fù)制周期,對(duì)尋找新的保守的抗流感病毒靶標(biāo),進(jìn)而研制新的抗流感病毒藥物具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室利用siRNA全基因組文庫篩選影響流感病毒復(fù)制的宿主因子,獲得宿主因子——包含DENN結(jié)構(gòu)域蛋白1B(DENN Domain-containing protein 1B,DENND1B),在此基礎(chǔ)上,通過siRNA干擾和CRISPR Cas9系統(tǒng)驗(yàn)證siRNA篩選結(jié)果,并通過慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)系統(tǒng)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的過表達(dá)系統(tǒng),驗(yàn)證了宿主因子DENND1B正調(diào)控流感病毒的復(fù)制,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)宿主因子DENND1B調(diào)控病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域是N端結(jié)構(gòu)域。同時(shí),我們研究發(fā)現(xiàn)宿主因子DENND1B能夠與流感病毒PB1蛋白以及PA蛋白相互作用,其作用的關(guān)鍵區(qū)域是DENND1B的C端結(jié)構(gòu)域。深入研究結(jié)果表明,流感病毒感染誘導(dǎo)AP2B1亞細(xì)胞定位改變,DENND1B能夠調(diào)控AP2B1蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞定位。此外,上調(diào)宿主因子DENND1B表達(dá)后,能夠加速病毒感染早期AP2B1、DENND1B以及NP蛋白指示的流感病毒向細(xì)胞膜的聚集以及共定位,表明宿主因子DENND1B主要通過影響內(nèi)吞環(huán)節(jié)來影響流感病毒復(fù)制。本研究初步揭示了宿主因子DENND1B調(diào)控流感病毒感染后內(nèi)吞環(huán)節(jié)的分子機(jī)制,豐富了宿主因子與病毒蛋白互作網(wǎng)絡(luò),深化了對(duì)流感病毒復(fù)制周期的理解。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第二章 宿主因子 DENND1B 正調(diào)控流感病毒的復(fù)制.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.3.1 DENND1B 下調(diào)效果檢測(cè)我們分別將 Scrambled siRNA、siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞，48 h 后收細(xì)胞提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)。經(jīng)分析三條 siRNA 均能下調(diào) DENND1B 基因的轉(zhuǎn)水平，siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 分別下調(diào) DENND1B 基因轉(zhuǎn)錄水平 89%、44%、53%，iRNA-1 下調(diào) DENND1B 基因表達(dá)效果最明顯(圖 2.1)。同時(shí)我們利用 CRISPR Cas9 構(gòu)建ENND1B 的敲除細(xì)胞系，將 DENND1B 外顯子區(qū)域敲除后，經(jīng)驗(yàn)證成功敲除 DENND1B 基因(圖.2)。

將 DENND1B 外顯子區(qū)域敲除后，經(jīng)驗(yàn)證成功敲除 DENND1B 基因(圖2.2)。2.3.2 下調(diào) DENND1B 抑制流感病毒復(fù)制根據(jù) DENND1B 干擾下調(diào)結(jié)果顯示，DENND1B siRNA-1 下調(diào) DENND1B 轉(zhuǎn)錄水平最明顯，所以我們選擇 siRNA-1 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過 siRNA 干擾后感染 WSN 流感病毒，我們發(fā)現(xiàn)干擾圖 2.1 熒光定量 PCR 檢測(cè) DENND1B 基因 siRNA 干擾效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells圖 2.2 熒光定量 PCR 檢測(cè) DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells圖 2.3 siRNA 干擾下調(diào) DENND1B 表達(dá)抑制流感病毒復(fù)制Fig. 2.3 siRNA knockdown of DENND1Bdecreases IAV replication.圖 2.4 敲除下調(diào) DENND1B 表達(dá)抑制流感病毒復(fù)制Fig. 2.4 Knockout of DENND1Bby CRISPR Cas9 decreases IAV replication.

.2 下調(diào) DENND1B 抑制流感病毒復(fù)制根據(jù) DENND1B 干擾下調(diào)結(jié)果顯示，DENND1B siRNA-1 下調(diào) DENND1B 轉(zhuǎn)錄水平最明顯，我們選擇 siRNA-1 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過 siRNA 干擾后感染 WSN 流感病毒，我們發(fā)現(xiàn)干擾圖 2.1 熒光定量 PCR 檢測(cè) DENND1B 基因 siRNA 干擾效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells圖 2.2 熒光定量 PCR 檢測(cè) DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells
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