發(fā)布時間：2020-11-17 12:16

　　 背景:犬自發(fā)性腫瘤是人類腫瘤研究的理想模型,因此深入研究犬乳腺腫瘤的分子特征、基因表達以及治療都是非常有意義的。許多細菌作為藥物或載體用于腫瘤治療,細菌療法可能的原因有細菌本身的毒性作用、免疫系統的增強以及爭奪營養(yǎng)。研究目的:探究變形桿菌屬對犬乳腺腫瘤的腫瘤生長和肺臟轉移的作用,并研究細菌能否調節(jié)免疫系統和腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤和轉移的作用。方法:1.采用原代細胞培養(yǎng)獲得穩(wěn)定傳代犬乳腺腫瘤細胞,通過透射電鏡、核型分析、繪制生長曲線和計算增殖倍增時間、克隆形成試驗、免疫組織化學法(IHC)、細胞免疫化學法(ICC)、小鼠成瘤模型的建立以及支原體的檢測,對其特性進行鑒定。2.通過粘附性試驗、生長抑制性試驗和克隆形成試驗評估奇異變形桿菌在體外對新建立的犬和其他種屬的乳腺腫瘤細胞系的生長增殖作用。制備荷瘤小鼠模型,探究細菌經尾靜脈注射后在體內的分布情況、對腫瘤生長和自發(fā)性肺臟轉移的作用以及細菌療法的安全性。3.采用熱水酚法提取細菌的脂多糖(LPS),尾靜脈注射荷瘤小鼠體內,評估LPS對荷瘤小鼠腫瘤生長和轉移的作用。最后利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、IHC和Western Blotting方法探究細菌發(fā)揮抗腫瘤和抗轉移作用的機制。結果:1.原代細胞培養(yǎng)獲得一株穩(wěn)定傳代100代以上的細胞系,命名為CMT-7364,其原發(fā)腫瘤組織病理學結果診斷為導管乳頭狀癌,IHC結果表明該乳腺腫瘤為三陰性犬乳腺腫瘤,即雌激素(ER)、孕激素(PR)和人表皮生長因子-2(HER-2)的表達為陰性;細胞形態(tài)學觀察CMT-7364細胞呈上皮細胞特征;核型分析確定該細胞系來源于犬;IHC和ICC的結果顯示該細胞系為三陰性乳腺腫瘤細胞系,且處于上皮間質轉化(EMT)的過程,而異種移植腫瘤的表型與原發(fā)腫瘤是一致的;該細胞系既能在免疫缺陷的小鼠成瘤,也能在免疫健全的小鼠成瘤。2.奇異變形桿菌在體外發(fā)揮的是非特異性的溶細胞作用;在體內,該細菌菌株能靶向性聚集于腫瘤組織,隨著時間的增加細菌數量增加,并持續(xù)一段時間;21天治療試驗中發(fā)現該細菌能夠抑制荷瘤小鼠的原發(fā)腫瘤生長以及自發(fā)性肺臟轉移的產生,長期來說是具有一定的安全性。3.進一步研究發(fā)現細菌的LPS對荷瘤小鼠的腫瘤生長和自發(fā)性肺臟轉移沒有任何顯著的影響;ELISA試驗顯示細菌注射后能引起腫瘤局部短時的免疫反應;IHC和Western Blotting的結果表明細菌注射后下調了兩個缺氧標記物(即CAIX和HIF-la)的表達,這說明細菌調節(jié)了腫瘤缺氧微環(huán)境。結論:本研究成功地建立和鑒定了一株犬三陰性乳腺腫瘤細胞系,并能在免疫健全的小鼠成瘤。奇異變形桿菌在體外發(fā)揮非特異性的溶細胞作用,在體內能靶向分布于腫瘤組織,抑制原發(fā)腫瘤的生長和自發(fā)性肺臟轉移的形成。該細菌可能通過調節(jié)腫瘤局部的免疫反應和腫瘤缺氧微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤和抗轉移作用。
【學位單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.292
【部分圖文】：

１．４．１缺氧在腫瘤進展和轉移中的作用??缺氧干擾多種生理過程，影響著腫瘤的進展和轉移，包括血管屮成、轉移、化療和放療的耐??受以及腫瘤微環(huán)境如圖１－４所示。腫瘤的新生血管是異常的、不成熟和泄露的，這些新生的??血管為饑餓的腫瘤細胞提供充足的養(yǎng)分和氧氣，然而細胞數增加導致對氧氣的需求增加，使得??１１??

和ＴＧＦ－ｐｉ的表達情況。結果顯示該乳腺組織ＥＲ、ＰＲ和ＨＥＲ－２表達為陰性，上皮細胞的標記物??ＣＫ８／１８和Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ表達為細胞膜陽性，間質細胞的標記物Ｖｉｍｅｎｔｉｎ表達為細胞膜陽性，間質??細胞的標記物ＴＧＦ－ｐｌ表達為細胞漿陽性。（圖２－２）丨ＨＣ結果表明該犬原發(fā)乳腺腫瘤是三陰性乳??腺腫瘤，同時處于上皮間質轉化（ＥＭＴ）的過程。??２４??

ｉ??顧顧??圖２－１：原發(fā)的犬乳腺腫瘤。其中最大的腫瘤大小是６．５?ｃｍ?ｘ?４．０ｃｍ?Ｘ?３．５?ｃｍ?（Ａ）。石蠟切片染色結果顯示腫瘤??細胞核大小顯著不一，核仁深染（Ｂ和Ｃ），通常含有一個或更多的核仁和有絲分裂相（箭頭所指）。免疫組化染??色結果顯示該原發(fā)腫瘤組織細胞核Ｋｉ－６７染色陽性，陽性染色細胞呈黃棕色（箭頭所指）。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１：?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｃａｎｉｎｅ?ｍａｍｍａｒｙ?ｃａｒｃｉｎｏｍａ．?Ｔｈｅ?ｂｉｇｇｅｓｔ?ｔｕｍｏｒ?ｗｈｉｃｈ?ｔｈｅ?ＣＭＴ－７３６４?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅ?ｗａｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍ??ｗａｓ?ａｂｏｕｔ?６．５?ｃｍ?ｘ?４．０?ｃｍ?ｘ?３．５?ｃｍ?（Ａ）．?Ｔｕｍｏｒ?ｃｅｌｌｓ?ｉｎ?ｐａｒａｆｆｉｎ?ｓｅｃｔｉｏｎｓ?ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ?ｍａｒｋｅｄ?ｖａｒｉａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｎｕｃｌｅａｒ?ｓｉｚｅ?ａｎｄ??ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｃ?ｎｕｃｌｅｕｓ?（Ｂ?ａｎｄ?Ｃ），?ｏｆｔｅｎ?ｗｉｔｈ?ｏｎｅ?ｏｒ?ｍｏｒｅ?ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ?ｎｕｃｌｅｏｌｉ?ａｎｄ?ｍｉｔｏｓｅｓ?（ａｒｒｏｗ）．?Ｔｉｓｓｕｅｓ?ｆｒｏｍ?ｐｒｉｍａｒｙ??ｔｕｍｏｒ?ｗｅｒｅ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｔｏ?Ｋｉ６７?ｉｎ?ｔｈｅ?ｎｕｃｌｅｕｓ?ｂｙ?Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｓｔａｉｎｉｎｇ．??２．３．２原發(fā)腫痗是三陰性犬乳腺腫瘤??組織免疫化學方法檢測該乳腺腫瘤組織中ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ－２、ＣＫ８／Ｉ８、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ??和ＴＧＦ－ｐｉ的表達情況。結果顯示該乳腺組織ＥＲ、ＰＲ和ＨＥＲ－２表達為陰性
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本文編號：2887487