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奇異變形桿菌抑制犬乳腺腫瘤的生長(zhǎng)和自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移的研究

發(fā)布時(shí)間:2020-11-17 12:16
   背景:犬自發(fā)性腫瘤是人類腫瘤研究的理想模型,因此深入研究犬乳腺腫瘤的分子特征、基因表達(dá)以及治療都是非常有意義的。許多細(xì)菌作為藥物或載體用于腫瘤治療,細(xì)菌療法可能的原因有細(xì)菌本身的毒性作用、免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)以及爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。研究目的:探究變形桿菌屬對(duì)犬乳腺腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)和肺臟轉(zhuǎn)移的作用,并研究細(xì)菌能否調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤和轉(zhuǎn)移的作用。方法:1.采用原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得穩(wěn)定傳代犬乳腺腫瘤細(xì)胞,通過透射電鏡、核型分析、繪制生長(zhǎng)曲線和計(jì)算增殖倍增時(shí)間、克隆形成試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)法(IHC)、細(xì)胞免疫化學(xué)法(ICC)、小鼠成瘤模型的建立以及支原體的檢測(cè),對(duì)其特性進(jìn)行鑒定。2.通過粘附性試驗(yàn)、生長(zhǎng)抑制性試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)評(píng)估奇異變形桿菌在體外對(duì)新建立的犬和其他種屬的乳腺腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖作用。制備荷瘤小鼠模型,探究細(xì)菌經(jīng)尾靜脈注射后在體內(nèi)的分布情況、對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移的作用以及細(xì)菌療法的安全性。3.采用熱水酚法提取細(xì)菌的脂多糖(LPS),尾靜脈注射荷瘤小鼠體內(nèi),評(píng)估LPS對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。最后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、IHC和Western Blotting方法探究細(xì)菌發(fā)揮抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制。結(jié)果:1.原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得一株穩(wěn)定傳代100代以上的細(xì)胞系,命名為CMT-7364,其原發(fā)腫瘤組織病理學(xué)結(jié)果診斷為導(dǎo)管乳頭狀癌,IHC結(jié)果表明該乳腺腫瘤為三陰性犬乳腺腫瘤,即雌激素(ER)、孕激素(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子-2(HER-2)的表達(dá)為陰性;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察CMT-7364細(xì)胞呈上皮細(xì)胞特征;核型分析確定該細(xì)胞系來源于犬;IHC和ICC的結(jié)果顯示該細(xì)胞系為三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞系,且處于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程,而異種移植腫瘤的表型與原發(fā)腫瘤是一致的;該細(xì)胞系既能在免疫缺陷的小鼠成瘤,也能在免疫健全的小鼠成瘤。2.奇異變形桿菌在體外發(fā)揮的是非特異性的溶細(xì)胞作用;在體內(nèi),該細(xì)菌菌株能靶向性聚集于腫瘤組織,隨著時(shí)間的增加細(xì)菌數(shù)量增加,并持續(xù)一段時(shí)間;21天治療試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌能夠抑制荷瘤小鼠的原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)以及自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生,長(zhǎng)期來說是具有一定的安全性。3.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的LPS對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移沒有任何顯著的影響;ELISA試驗(yàn)顯示細(xì)菌注射后能引起腫瘤局部短時(shí)的免疫反應(yīng);IHC和Western Blotting的結(jié)果表明細(xì)菌注射后下調(diào)了兩個(gè)缺氧標(biāo)記物(即CAIX和HIF-la)的表達(dá),這說明細(xì)菌調(diào)節(jié)了腫瘤缺氧微環(huán)境。結(jié)論:本研究成功地建立和鑒定了一株犬三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞系,并能在免疫健全的小鼠成瘤。奇異變形桿菌在體外發(fā)揮非特異性的溶細(xì)胞作用,在體內(nèi)能靶向分布于腫瘤組織,抑制原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移的形成。該細(xì)菌可能通過調(diào)節(jié)腫瘤局部的免疫反應(yīng)和腫瘤缺氧微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。
【學(xué)位單位】:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:S858.292
【部分圖文】:

血管,需求增加,生理過程,不成熟


1.4.1缺氧在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用??缺氧干擾多種生理過程,影響著腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,包括血管屮成、轉(zhuǎn)移、化療和放療的耐??受以及腫瘤微環(huán)境如圖1-4所示。腫瘤的新生血管是異常的、不成熟和泄露的,這些新生的??血管為饑餓的腫瘤細(xì)胞提供充足的養(yǎng)分和氧氣,然而細(xì)胞數(shù)增加導(dǎo)致對(duì)氧氣的需求增加,使得??11??

乳腺腫瘤,標(biāo)記物,間質(zhì),三陰


和TGF-pi的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該乳腺組織ER、PR和HER-2表達(dá)為陰性,上皮細(xì)胞的標(biāo)記物??CK8/18和E-Cadherin表達(dá)為細(xì)胞膜陽(yáng)性,間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Vimentin表達(dá)為細(xì)胞膜陽(yáng)性,間質(zhì)??細(xì)胞的標(biāo)記物TGF-pl表達(dá)為細(xì)胞漿陽(yáng)性。(圖2-2)丨HC結(jié)果表明該犬原發(fā)乳腺腫瘤是三陰性乳??腺腫瘤,同時(shí)處于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程。??24??

免疫組化染色,乳腺腫瘤,核仁,三陰


i??顧顧??圖2-1:原發(fā)的犬乳腺腫瘤。其中最大的腫瘤大小是6.5?cm?x?4.0cm?X?3.5?cm?(A)。石蠟切片染色結(jié)果顯示腫瘤??細(xì)胞核大小顯著不一,核仁深染(B和C),通常含有一個(gè)或更多的核仁和有絲分裂相(箭頭所指)。免疫組化染??色結(jié)果顯示該原發(fā)腫瘤組織細(xì)胞核Ki-67染色陽(yáng)性,陽(yáng)性染色細(xì)胞呈黃棕色(箭頭所指)。??Figure?2-1:?Primary?canine?mammary?carcinoma.?The?biggest?tumor?which?the?CMT-7364?cell?line?was?derived?from??was?about?6.5?cm?x?4.0?cm?x?3.5?cm?(A).?Tumor?cells?in?paraffin?sections?exhibited?marked?variation?in?nuclear?size?and??hyperchromatic?nucleus?(B?and?C),?often?with?one?or?more?prominent?nucleoli?and?mitoses?(arrow).?Tissues?from?primary??tumor?were?positive?to?Ki67?in?the?nucleus?by?Immunohistochemical?staining.??2.3.2原發(fā)腫痗是三陰性犬乳腺腫瘤??組織免疫化學(xué)方法檢測(cè)該乳腺腫瘤組織中ER、PR、HER-2、CK8/I8、Vimentin、E-Cadherin??和TGF-pi的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該乳腺組織ER、PR和HER-2表達(dá)為陰性
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