發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 11:37

　　 豬德爾塔冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的腸道致病性冠狀病毒。仔豬感染PDCoV后出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀,有較高的發(fā)病率和死亡率,是導(dǎo)致仔豬死亡的重要原因之一。目前,在多個(gè)國家和地區(qū)都檢測到了 PDCoV,在國內(nèi)多個(gè)省份也有該病毒的相關(guān)報(bào)道。鑒于PDCoV在豬群中的廣泛流行性及潛在威脅,本研究建立了檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法和細(xì)胞免疫組化法,以及檢測PDCoV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。1.檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法的建立本研究通過DNAStar Protean軟件對(duì)PDCoV N蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析,選取抗原性較強(qiáng)的區(qū)段(265～342 aa),根據(jù)大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)并人工合成了對(duì)應(yīng)的基因片段N-Opti。分別利用pET-32a和pGEX-6p-1表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá),獲得的兩種融合蛋白分別帶有His和GST標(biāo)簽,命名為PDCoV-N-His和PDCoV-N-GST,且均呈可溶性表達(dá)。Western Blot鑒定結(jié)果顯示兩個(gè)重組蛋白大小均與預(yù)期相符,分別約為31 kDa 和 36 kDa。利用Ni-NTA親和層析介質(zhì)和高親和力GST純化介質(zhì),分別純化出兩種重組蛋白作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測,經(jīng)比較,以PDCoV-N-His作為包被抗原檢測效果更好。最終以PDCoV-N-His作為包被抗原建立了檢測PDCoV特異性抗體的間接ELISA方法。經(jīng)測定,該方法具有良好的特異性且重復(fù)性良好,與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PRoV)特異性陽性血清無交叉反應(yīng),批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%。應(yīng)用該方法對(duì)20份己知陽性血清和20份陰性血清分別進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示陽性符合率為100%(20/20),陰性符合率為100%(20/20),表明方法的特異性良好,可以進(jìn)一步用于PDCoV感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。2.檢測PDCoV抗體的細(xì)胞免疫組化法的建立根據(jù)完整PDCoV N基因序列設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR方法克隆N基因,進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)N蛋白的慢病毒載體。以包裝的慢病毒感染Vero細(xì)胞,通過4μg/mL的嗓呤霉素篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)N蛋白的重組細(xì)胞系Vero/PDCoV-N。經(jīng)Western Blot鑒定,該細(xì)胞系能表達(dá)與預(yù)期大小相符的41 kDa的蛋白條帶。應(yīng)用該細(xì)胞系進(jìn)一步建立了檢測PDCoV特異性抗體的細(xì)胞免疫組化檢測方法。應(yīng)用該方法檢測已知PDCoV陽性血清,顯色后細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)特異性棕褐色,而作為對(duì)照的Vero細(xì)胞無任何顏色反應(yīng)。該方法的建立為PDCoV感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了另外一種有效的血清學(xué)檢測方法。3.檢測PDCoV抗原的雙單抗夾心ELISA方法的建立本研究以PDCoV-N-His蛋白為免疫原,以PDCoV-N-GST蛋白為檢測抗原,采用雜交瘤技術(shù),經(jīng)ELISA篩選獲得了 6株能穩(wěn)定分泌針對(duì)PDCoVN蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1A2、4C5、5C5、8C12、8E8、10A7。亞類鑒定結(jié)果顯示,在6株單抗中,4株為IgGi亞型,2株為IgM亞型。對(duì)6株單抗的相對(duì)親和力和抗原結(jié)合表位進(jìn)行綜合分析,選擇1A2為捕獲抗體,HRP偶聯(lián)的5C5為檢測抗體,建立了雙抗體夾心ELISA方法。該方法的雙對(duì)數(shù)回歸擬合線線性相關(guān)系數(shù)大于0.99,通過回歸方程確定定量分析PDCoVN蛋白的檢測范圍為80 ng/mL～1.3μg/mL。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%,表明方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。本研究建立的雙單抗夾心ELISA方法展示出對(duì)重組N蛋白的良好檢測效果,有望以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步開發(fā)出可用于臨床PDCoV感染診斷的特異性抗原檢測方法。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

部分ＰＤＣｏＶ陽性樣品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。為應(yīng)對(duì)ＰＤＣｏＶ對(duì)美國豬群的影響，２０１４年６月５??日美國農(nóng)業(yè)部頒布了一項(xiàng)法令，要求及時(shí)上報(bào)所有的豬腹瀉病例［５１】。隨后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰國［５３］、韓國１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中國［５７，５８］等地均有出現(xiàn)和報(bào)道（圖１．３），呈現(xiàn)??全球流行的趨勢。??戰(zhàn)??圖１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布圖［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ＰＤＣｏＶ以來，中國其他地區(qū)不斷出現(xiàn)了?ｒｏＣｏＶ的相??關(guān)報(bào)道。２０１２年下半年，中國西部四川地區(qū)檢測到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】對(duì)黑龍??江地區(qū)的３１９份豬腹瀉病料進(jìn)行檢測，ＰＤＣｏＶ陽性率為１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，對(duì)中國??南部部分省份地區(qū)的哺乳仔豬進(jìn)行檢測，整體發(fā)病率僅１．２８％，雖然檢出率較低，但幾乎??每個(gè)省份都有ＰＤＣｏＶ檢出〖６義２０１６年，天津某豬場出現(xiàn)仔豬腹瀉，趙峰等［５７］從該豬場發(fā)??病仔豬糞便中檢測到ＰＤＣｏＶ，命名為ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，經(jīng)全基因測序分析其核苷酸序列??與中國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)：ＫＪ７６９２３１

部分ＰＤＣｏＶ陽性樣品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。為應(yīng)對(duì)ＰＤＣｏＶ對(duì)美國豬群的影響，２０１４年６月５??日美國農(nóng)業(yè)部頒布了一項(xiàng)法令，要求及時(shí)上報(bào)所有的豬腹瀉病例［５１】。隨后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰國［５３］、韓國１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中國［５７，５８］等地均有出現(xiàn)和報(bào)道（圖１．３），呈現(xiàn)??全球流行的趨勢。??戰(zhàn)??圖１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布圖［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ＰＤＣｏＶ以來，中國其他地區(qū)不斷出現(xiàn)了?ｒｏＣｏＶ的相??關(guān)報(bào)道。２０１２年下半年，中國西部四川地區(qū)檢測到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】對(duì)黑龍??江地區(qū)的３１９份豬腹瀉病料進(jìn)行檢測，ＰＤＣｏＶ陽性率為１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，對(duì)中國??南部部分省份地區(qū)的哺乳仔豬進(jìn)行檢測，整體發(fā)病率僅１．２８％，雖然檢出率較低，但幾乎??每個(gè)省份都有ＰＤＣｏＶ檢出〖６義２０１６年，天津某豬場出現(xiàn)仔豬腹瀉，趙峰等［５７］從該豬場發(fā)??病仔豬糞便中檢測到ＰＤＣｏＶ，命名為ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，經(jīng)全基因測序分析其核苷酸序列??與中國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)：ＫＪ７６９２３１

智能生化培養(yǎng)箱?常州恒隆儀器有限公司??電子天平?上海越平科學(xué)儀器有限公司??法??ＤＣｏＶＮ蛋白的原核表達(dá)???ＰＤＣｏＶＮ蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建??過ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ軟件，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室測定的ＰＤＣｏＶＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６株列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號(hào)：ＫＹ０６５１２０）進(jìn)行分析，挑選其中抗原性較好的一），根據(jù)大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性規(guī)律，對(duì)其基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化隆，基因片段兩端分別加上Ｉ和說〇?Ｉ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，優(yōu)０＾／委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。利用限制性內(nèi)切酶將人工合成的Ｎ基因片段定向克隆入原核表達(dá)載體ｐＥＴ－３２ａ和ｐＧＥＸ－６ｐ－，獲得重組質(zhì)粒?ｐＥＴ－３２ａ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ?和?ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ，如Ａ?＾＾ＴＯＣｏＶ－ＮＪＪｐｔｉ?Ｂ?ｕｃｐｒｏｍ？？??
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 忻宏偉;;德爾塔巴流量計(jì)在水泥低溫余熱發(fā)電工程的應(yīng)用[J];自動(dòng)化應(yīng)用;2012年01期

2 Miriam Bilstein;;優(yōu)化德爾塔拾放機(jī)器人[J];工業(yè)設(shè)計(jì);2008年03期

3 吳斌;德爾塔技術(shù)(Delta Technology)[J];云南印刷;1996年05期

4 張雪;;危險(xiǎn)的“德爾塔1”[J];中國新聞周刊;2011年36期

5 沈家明;;德爾塔巴流量計(jì)測量系統(tǒng)探討[J];中國儀器儀表;2010年06期

6 柳玉松;索海倫;周仲虎;;德爾塔巴流量計(jì)在干法脫硫中的應(yīng)用[J];貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年05期

7 劉雙喜;;西斯特德爾塔巴在鍋爐汽包液位三沖量控制中的應(yīng)用[J];自動(dòng)化應(yīng)用;2013年12期

8 劉雅婷;;阿爾法與德爾塔[J];中學(xué)生;2013年08期

9 岳瑞峰;邵偉文;;VaR方法的一種改進(jìn)模型[J];河南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年06期

10 萬遂如;;豬德爾塔冠狀病毒感染的防控[J];養(yǎng)豬;2016年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 錢炳旭;豬德爾塔冠狀病毒抗原及抗體檢測方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 盧曼曼;豬德爾塔冠狀病毒受體的篩選與鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 李佳佳;應(yīng)用于移動(dòng)領(lǐng)域的D類音頻放大器的設(shè)計(jì)[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

4 于桂明;浮選充氣過程測控系統(tǒng)的研究與設(shè)計(jì)[D];昆明理工大學(xué);2014年

5 王宗杰;海參養(yǎng)殖環(huán)境耐藥菌分析及三株海洋新菌的分類鑒定[D];山東大學(xué);2015年

6 李輝;柑橘新種質(zhì)的創(chuàng)造及鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2887460