發(fā)布時間：2020-11-16 12:11

　　 豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于豬感染胞內(nèi)勞森氏菌引起的一種傳染性腸道出血性的消耗性疾病,1931年Bieste和Sohwarce首次報道了該病,1974年Rowland等證實了該病,該病現(xiàn)已成為世界上流行最廣的豬病之一。雖然,豬增生性腸炎引l起的死亡率不高,但由于其主要發(fā)病為慢性型,使得患病豬生長緩慢,飼料利用率和平均日增重明顯下降,淘汰率上升,導(dǎo)致豬場經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。一些養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū),由于飼料中抗生素的禁用或限用,導(dǎo)致豬增生性腸炎發(fā)病率逐年上升。在我國,臨床豬增生性腸炎疑似病例有逐漸增多的趨勢,但我國對豬增生性腸炎的研究還處于起步階段,缺乏對該病的流行病學(xué)調(diào)查,因此開發(fā)快速準(zhǔn)確的臨床檢測方法對于該病的研究具有重要的意義。本試驗根據(jù)引物設(shè)計原理,針對胞內(nèi)勞森氏菌AM18025.2.1基因序列分別設(shè)計了PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)特異性引物,通過對PCR方法退火溫度的優(yōu)化,LAMP方法的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、內(nèi)外引物比例、dNTP濃度、鎂離子濃度、甜菜堿的優(yōu)化,確定其最優(yōu)反應(yīng)條件后成功建立了胞內(nèi)勞森氏菌的PCR和LAMP兩種檢測方法。靈敏度實驗結(jié)果表明建立的PCR方法可檢出的拷貝數(shù)為103個,LAMP方法可檢出的拷貝數(shù)為10’個；特異性試驗表明,PCR方法和LAMP方法對E.coli、Salmonella、PEDV、PRV擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,且這兩種方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物還可進(jìn)行可視化檢測,陽性反應(yīng)產(chǎn)物在自然光下出現(xiàn)明顯渾濁,加入SYBR Green Ⅰ染料后,在紫外燈照下,陽性反應(yīng)管發(fā)出綠色熒光,而陰性反應(yīng)管無熒光現(xiàn)象出現(xiàn)。應(yīng)用本試驗建立的PCR和LAMP兩種方法檢測從四川部分規(guī)�；�養(yǎng)豬場采集的114份糞便樣本,其中60份樣本(52.6%)利用PCR和LAMP檢測方法均檢出為陽性,13份樣本(11.4%)利用LAMP檢測方法檢出為陽性,PCR檢測方法檢出為陰性,41份樣本(36.0%)利用PCR和LAMP檢測方法均檢出為陰性。應(yīng)用FIRSTtest試劑盒進(jìn)行復(fù)核檢測,PCR檢測方法的符合率為76.0%,LAMP檢測方法的符合率為92.4%,LAMP檢測方法具有更高的靈敏度。胞內(nèi)勞森氏菌引起的豬增生性腸炎造成的死亡率不高,但是對豬場的經(jīng)濟(jì)造成較大的損失,且該病目前在我國感染率較高。本試驗所建立的PCR和LAMP兩種方法具有快速簡便的特點(diǎn),且LAMP方法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備,反應(yīng)條件簡便,成本較低,適用于實驗室和現(xiàn)場快速檢測。本試驗建立的PCR和LAMP方法為胞內(nèi)勞森氏菌的檢測提供了一定的參考。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.61
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表（Abbreviations）
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬增生性腸炎概述
        1.1 病原學(xué)及其研究進(jìn)展
            1.1.1 病原的分類及其結(jié)構(gòu)特征
            1.1.2 致病機(jī)理
        1.2 流行病學(xué)及其研究進(jìn)展
            1.2.1 易感動物和傳染源
            1.2.2 地理分布及傳播途徑
        1.3 臨床癥狀及病理變化
        1.4 診斷方法
            1.4.1 組織病理學(xué)診斷
            1.4.2 血清學(xué)診斷法
            1.4.3 分子生物學(xué)診斷
            1.4.4 FIRSTtest試劑盒診斷
        1.5 防治措施
    2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)
        2.1 技術(shù)特點(diǎn)
        2.2 技術(shù)原理
        2.3 引物設(shè)計原則
        2.4 LAMP反應(yīng)體系
    3 研究目的與意義
第二章 胞內(nèi)勞森氏菌檢測方法的建立
    1 實驗材料
        1.1 實驗材料
        1.2 主要儀器
        1.3 實驗試劑
        1.4 相關(guān)試劑配制
    2 質(zhì)粒模版的制備
        2.1 胞內(nèi)勞森氏菌質(zhì)粒的制備
        2.2 胞內(nèi)勞森氏菌質(zhì)粒濃度測定
        2.3 糞便樣品DNA的制備
        2.4 其他細(xì)菌及病毒DNA或RNA的制備
    3 胞內(nèi)勞森氏菌檢測方法的建立
        3.1 引物的設(shè)計與合成
        3.2 引物的驗證
            3.2.1 LAMP引物的驗證
            3.2.2 LAMP結(jié)果判定
            3.2.3 PCR引物的驗證
            3.2.4 PCR結(jié)果判定
        3.3 PCR產(chǎn)物克隆測序鑒定
            3.3.1 PCR擴(kuò)增片段的膠回收
            3.3.2 重組質(zhì)粒的連接
2法）及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化'>            3.3.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl₂法）及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.3.4 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.3.5 測序鑒定
        3.4 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化
            3.4.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化
            3.4.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化
            3.4.3 內(nèi)外引物比例的優(yōu)化
            3.4.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            3.4.5 鎂離子濃度的優(yōu)化
            3.4.6 甜菜堿的作用
        3.5 PCR檢測方法條件的優(yōu)化
        3.6 靈敏度試驗
        3.7 特異性試驗
        3.8 穩(wěn)定性試驗
        3.9 臨床應(yīng)用試驗
            3.9.1 臨床樣本的采集
            3.9.2 臨床樣本的檢測
            3.9.3 臨床樣本的復(fù)核檢測
    4 結(jié)果與分析
        4.1 質(zhì)粒模版測序以及濃度的測定
        4.2 引物驗證結(jié)果
        4.3 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化
            4.3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化
            4.3.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化
            4.3.3 內(nèi)外引物濃度比例的優(yōu)化
            4.3.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            4.3.5 鎂離子濃度的優(yōu)化
            4.3.6 甜菜堿的作用
        4.4 LAMP反應(yīng)條件的確立
        4.5 胞內(nèi)勞森氏菌LAMP可視化檢測
        4.6 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及條件的確立
        4.7 靈敏性試驗
        4.8 特異性試驗
        4.9 穩(wěn)定性試驗
        4.10 臨床樣本檢測
TM試劑盒檢測'>        4.11 FISRTtest^TM試劑盒檢測
    5 討論
        5.1 胞內(nèi)勞森氏菌質(zhì)粒模版的制備
        5.2 建立方法的分析
        5.3 反應(yīng)條件對LAMP的影響
            5.3.1 反應(yīng)溫度對LAMP反應(yīng)的影響
            5.3.2 內(nèi)外引物比例對LAMP反應(yīng)的影響
            5.3.3 鎂離子濃度對LAMP反應(yīng)的影響
            5.3.4 反應(yīng)時間對LAMP反應(yīng)的影響
            5.3.5 其他條件對LAMP反應(yīng)的影響
        5.4 假陽性分析及應(yīng)對措施
        5.5 臨床樣本分析
第三章 實驗創(chuàng)新點(diǎn)及結(jié)論
    1 實驗創(chuàng)新點(diǎn)
    2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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