發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 14:39

　　 作為Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors,KLF)家族成員之一,KLF10具有三個(gè)高度保守的Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu),調(diào)控著細(xì)胞的很多功能。最近有學(xué)者在小鼠3T3-L1細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)KLF10與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。但在反芻動(dòng)物尤其是山羊(Capra hircus)上尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明KLF10可能參加山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。因此本研究以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物,利用細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)、Western Blot、過(guò)表達(dá)、RNA干擾和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等方法在克隆獲得山羊KLF10基因序列的基礎(chǔ)上,明確了KLF10對(duì)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用及闡明了其可能的作用機(jī)制。主要獲得以下研究成果:(1)成功克隆獲得山羊KLF10基因序列1457 bp,包括完整的CDS區(qū)1449bp,編碼482個(gè)氨基酸;篩選并確定了TBP為山羊組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,組織表達(dá)結(jié)果顯示KLF10在山羊各組織中存在廣泛表達(dá),且在脾和肺中表達(dá)水平最高(P0.01)。(2)在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,KLF10表達(dá)水平總體呈上升趨勢(shì);過(guò)表達(dá)KLF10極顯著增加了肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴的積聚;過(guò)表達(dá)KLF10脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因C/EBPα表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),LPL和C/EBPβ表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05),SREBP1表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P0.01);過(guò)表達(dá)KLF10后KLF3、KLF14和KLF17的mRNA表達(dá)量極顯著上調(diào)(P0.01),KLF1和KLF16的mRNA的表達(dá)量也被顯著上調(diào)(P0.05),而KLF11的表達(dá)水平則顯著下調(diào)(P0.05)。(3)干擾KLF10后極顯著降低了山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴的積聚;同時(shí)干擾KLF10后LPL、AP2、C/EBPα和SREBP1表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P0.01),而Pref-1表達(dá)水平則被極顯著上調(diào)(P0.01);KLF1、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF11、KLF12、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17的mRNA表達(dá)量均受到抑制極顯著降低(P0.01),而KLF3的表達(dá)水平則顯著上調(diào)(P0.05)。(4)成功克隆得到山羊C/EBPα啟動(dòng)子序列并構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告載體,轉(zhuǎn)染至山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞后,檢測(cè)結(jié)果顯示KLF10過(guò)表達(dá)后C/EBPα啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)(P0.01)。綜上所述,本研究克隆獲得了山羊KLF10基因序列,并明確了其組織與細(xì)胞時(shí)序表達(dá)特性,綜合過(guò)表達(dá)和干擾結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF10促進(jìn)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化,并且這種調(diào)控作用可能是協(xié)同該家族部分成員通過(guò)C/EBPα來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S827
【部分圖文】：

該家族有三個(gè)亞型：PPARα、PPARδ 和 PPARγ。其中 PPARγ 主要在脂肪組織中表達(dá)，是決定脂肪細(xì)胞末端分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究表明在 PPARγ 缺失的情況下脂肪分化將無(wú)法進(jìn)行（Kim et al., 2001）。當(dāng) PPARγ 過(guò)表達(dá)后可以促使其他細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，Yu 等對(duì)豬的 PPARγ 基因過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn) C2C12 成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞（Yu et al., 2006）。研究表明許多轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化期間是通過(guò)促進(jìn)或者抑制 PPARγ 基因表達(dá)發(fā)揮作用的，PPARγ 和 TLE3 能夠協(xié)同發(fā)揮作用促進(jìn)脂肪生成（Villanueva et al., 2011）。還有 C/EBP 家族、GATA2（GATA binding protein 2）和 GATA3（GA-TA binding protein 3）等均通過(guò)調(diào)控PPARγ 發(fā)揮調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的作用（圖 1-1）。

圖 1-2 KLF 異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分組織胚胎發(fā)育以及維持機(jī)體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)研現(xiàn)多個(gè) KLFs 家族成員參與脂肪細(xì)胞分化調(diào)控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13KLF15 已經(jīng)被正式確認(rèn)在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，KLF2、

圖 1-2 KLF 異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、組織胚胎發(fā)育以及維持機(jī)體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè) KLFs 家族成員參與脂肪細(xì)胞分化調(diào)控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13和 KLF15 已經(jīng)被正式確認(rèn)在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，KLF2、KLF3 和 KLF7 則起到抑制脂肪細(xì)胞分化的作用。
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本文編號(hào)：2883586