發(fā)布時間：2020-11-14 14:39

　　 作為Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors,KLF)家族成員之一,KLF10具有三個高度保守的Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu),調(diào)控著細胞的很多功能。最近有學者在小鼠3T3-L1細胞系中發(fā)現(xiàn)KLF10與脂肪細胞分化有關(guān)。但在反芻動物尤其是山羊(Capra hircus)上尚未見到相關(guān)報道,本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明KLF10可能參加山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化。因此本研究以簡州大耳羊為試驗動物,利用細胞培養(yǎng)、實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)、Western Blot、過表達、RNA干擾和雙熒光素酶報告實驗等方法在克隆獲得山羊KLF10基因序列的基礎(chǔ)上,明確了KLF10對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的調(diào)控作用及闡明了其可能的作用機制。主要獲得以下研究成果:(1)成功克隆獲得山羊KLF10基因序列1457 bp,包括完整的CDS區(qū)1449bp,編碼482個氨基酸;篩選并確定了TBP為山羊組織器官中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,組織表達結(jié)果顯示KLF10在山羊各組織中存在廣泛表達,且在脾和肺中表達水平最高(P0.01)。(2)在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中,KLF10表達水平總體呈上升趨勢;過表達KLF10極顯著增加了肌內(nèi)脂肪細胞中脂滴的積聚;過表達KLF10脂肪細胞分化標志基因C/EBPα表達水平顯著上調(diào)(P0.05),LPL和C/EBPβ表達水平顯著下調(diào)(P0.05),SREBP1表達水平極顯著下調(diào)(P0.01);過表達KLF10后KLF3、KLF14和KLF17的mRNA表達量極顯著上調(diào)(P0.01),KLF1和KLF16的mRNA的表達量也被顯著上調(diào)(P0.05),而KLF11的表達水平則顯著下調(diào)(P0.05)。(3)干擾KLF10后極顯著降低了山羊肌內(nèi)脂肪細胞中脂滴的積聚;同時干擾KLF10后LPL、AP2、C/EBPα和SREBP1表達水平極顯著下調(diào)(P0.01),而Pref-1表達水平則被極顯著上調(diào)(P0.01);KLF1、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF11、KLF12、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17的mRNA表達量均受到抑制極顯著降低(P0.01),而KLF3的表達水平則顯著上調(diào)(P0.05)。(4)成功克隆得到山羊C/EBPα啟動子序列并構(gòu)建其熒光素酶報告載體,轉(zhuǎn)染至山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞后,檢測結(jié)果顯示KLF10過表達后C/EBPα啟動子活性顯著增強(P0.01)。綜上所述,本研究克隆獲得了山羊KLF10基因序列,并明確了其組織與細胞時序表達特性,綜合過表達和干擾結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF10促進山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化,并且這種調(diào)控作用可能是協(xié)同該家族部分成員通過C/EBPα來實現(xiàn)的。
【學位單位】：西南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

該家族有三個亞型：PPARα、PPARδ 和 PPARγ。其中 PPARγ 主要在脂肪組織中表達，是決定脂肪細胞末端分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究表明在 PPARγ 缺失的情況下脂肪分化將無法進行（Kim et al., 2001）。當 PPARγ 過表達后可以促使其他細胞轉(zhuǎn)化為脂肪細胞，Yu 等對豬的 PPARγ 基因過表達后發(fā)現(xiàn) C2C12 成肌細胞轉(zhuǎn)化為脂肪細胞（Yu et al., 2006）。研究表明許多轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脂肪細胞分化期間是通過促進或者抑制 PPARγ 基因表達發(fā)揮作用的，PPARγ 和 TLE3 能夠協(xié)同發(fā)揮作用促進脂肪生成（Villanueva et al., 2011）。還有 C/EBP 家族、GATA2（GATA binding protein 2）和 GATA3（GA-TA binding protein 3）等均通過調(diào)控PPARγ 發(fā)揮調(diào)控脂肪細胞分化的作用（圖 1-1）。

圖 1-2 KLF 異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調(diào)節(jié)哺乳動物多種生物過程，包括細胞增殖、凋亡、分組織胚胎發(fā)育以及維持機體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過體內(nèi)和體外試驗研現(xiàn)多個 KLFs 家族成員參與脂肪細胞分化調(diào)控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13KLF15 已經(jīng)被正式確認在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進脂肪細胞分化，KLF2、

圖 1-2 KLF 異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調(diào)節(jié)哺乳動物多種生物過程，包括細胞增殖、凋亡、分化、組織胚胎發(fā)育以及維持機體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過體內(nèi)和體外試驗研究發(fā)現(xiàn)多個 KLFs 家族成員參與脂肪細胞分化調(diào)控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13和 KLF15 已經(jīng)被正式確認在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進脂肪細胞分化，KLF2、KLF3 和 KLF7 則起到抑制脂肪細胞分化的作用。
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本文編號：2883586