發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 13:56

　　 水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease of mink virus,ADV)引起的以漿細(xì)胞增多為主要特征的慢性、消耗性、病毒性傳染病。主要侵害水貂的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂,死亡率極高,嚴(yán)重?fù)p害了水貂養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,該病存在于絕大多數(shù)養(yǎng)殖水貂的國(guó)家和地區(qū)。目前,能有效預(yù)防該病的疫苗尚未研制成功,該病的防治已成為水貂養(yǎng)殖領(lǐng)域的世界性難題,在防治方面主要采取檢疫淘汰陽(yáng)性貂的辦法。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)與膠體金免疫層析技術(shù),針對(duì)ADV抗體快速檢測(cè)試紙條技術(shù)進(jìn)行了初步研究。?應(yīng)用生物軟件分析截取實(shí)驗(yàn)室分離的ADV流行毒株ADV-DL125株基因VP2基因抗原表位區(qū)705 bp片段。設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-28a(+)連接,獲得原核表達(dá)載體pET-28a-VP2a。將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,可在大約28KD處獲得特異性蛋白條帶。經(jīng)Co-NTA親和層析法得到VP2a純化蛋白,WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明,pET-28a-VP2a蛋白能夠與ADV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。?利用檸檬酸三鈉還原法制備不同直徑大小的膠體金顆粒,確定直徑30 nm的膠體金顆粒用于標(biāo)記蛋白。根據(jù)膠體金免疫層析的原理,本實(shí)驗(yàn)用膠體金標(biāo)記純化后的VP2a蛋白作為金標(biāo)墊,純化后的VP2a蛋白作為NC膜上檢測(cè)線(T)的劃線抗原,純化的ADV陽(yáng)性血清IgG作為NC膜上質(zhì)控線(C)的劃線抗體。通過(guò)優(yōu)化各反應(yīng)條件,確定金標(biāo)蛋白最佳標(biāo)記濃度為10μg/mL,最佳標(biāo)記pH為8.69,T線抗原濃度為0.7 mg/mL,C線抗體濃度為0.9 mg/mL。試紙條特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明,本研究所研制的試紙條能與水貂ADV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),與水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎、圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清不反應(yīng),與對(duì)流免疫電泳的符合率可達(dá)92.9%。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.92
【部分圖文】：

懸浮物轉(zhuǎn)移到的底部有可開閉出將還留在管壁上的填料沖洗出并收集流出液。用 5 mL 清洗脫液洗脫組氨酸標(biāo)簽蛋白，重濃度。集到的所有流出液。S 進(jìn)行 50 倍稀釋，用超微量快8a-VP2a PCR 鑒定質(zhì)粒 pET-28a-VP2a 為模板擴(kuò)增大小約 705 bp 相符的目的條帶

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到約 705 bp 目的基因片段和約 5369 bp 的載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果如圖1-2。圖 1-2 重組質(zhì)粒 pET-28a-VP2a 的酶切鑒定M：DL15000DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：酶切產(chǎn)物Fig.1-2 Idention of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionenzyme digestionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige1.3.3 表達(dá) pET-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 檢測(cè)圖 1-3 中 3～8 為誘導(dǎo) 2～7h 的結(jié)果，可以看出在重組表達(dá)載體在誘導(dǎo) 4 h時(shí)蛋白量表達(dá)量最多。圖 1-4 中 2～7 為 IPTG 濃度分別為 0.2 mmol／L、0.4 mmol／L、0.6 mmol／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L 下誘導(dǎo) 5 h 蛋白表達(dá)量，可以看出 IPTG 終濃度為 0.8 mmol／L 時(shí)蛋白表達(dá)量最多，因此pET-28a-VP2a 蛋白誘導(dǎo)最佳條件為 0.8 mmol／L 的 IPTG 誘導(dǎo) 4 h 的蛋白表達(dá)量，其大小與預(yù)期結(jié)果約為 28 KD 相符。圖 1-3 pET-28a-VP2a 在 BL21 中的表達(dá)M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)前；2：空載體 pET-28a（+）；3～8：pET-28aVP2a 在 BL21（DE3）中誘導(dǎo) 2～7h 的表達(dá)結(jié)果Fig.1-3 Expression of pET-28a-VP2a in BL21（DE3）M: Low molecula

圖 1-2 重組質(zhì)粒 pET-28a-VP2a 的酶切鑒定M：DL15000DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：酶切產(chǎn)物 of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 檢測(cè)～8 為誘導(dǎo) 2～7h 的結(jié)果，可以看出在重組表達(dá)最多。圖 1-4 中 2～7 為 IPTG 濃度分別為 0.2 mm／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L看出 IPTG 終濃度為 0.8 mmol／L 時(shí)蛋白表白誘導(dǎo)最佳條件為 0.8 mmol／L 的 IPTG 誘導(dǎo) 4果約為 28 KD 相符。
【參考文獻(xiàn)】

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 劉維建;貓弓形蟲感染ELISA和膠體金試紙檢測(cè)方法建立與初步應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2883549