發(fā)布時間：2020-11-14 13:56

　　 水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease of mink virus,ADV)引起的以漿細胞增多為主要特征的慢性、消耗性、病毒性傳染病。主要侵害水貂的免疫系統(tǒng),導致機體免疫系統(tǒng)紊亂,死亡率極高,嚴重損害了水貂養(yǎng)殖產業(yè)的健康發(fā)展,該病存在于絕大多數(shù)養(yǎng)殖水貂的國家和地區(qū)。目前,能有效預防該病的疫苗尚未研制成功,該病的防治已成為水貂養(yǎng)殖領域的世界性難題,在防治方面主要采取檢疫淘汰陽性貂的辦法。本研究采用原核表達系統(tǒng)與膠體金免疫層析技術,針對ADV抗體快速檢測試紙條技術進行了初步研究。?應用生物軟件分析截取實驗室分離的ADV流行毒株ADV-DL125株基因VP2基因抗原表位區(qū)705 bp片段。設計特異性引物,對其進行PCR擴增。將PCR擴增產物與原核表達載體pET-28a(+)連接,獲得原核表達載體pET-28a-VP2a。將其轉入感受態(tài)細胞BL21(DE3),經IPTG誘導表達后,可在大約28KD處獲得特異性蛋白條帶。經Co-NTA親和層析法得到VP2a純化蛋白,WesternBlot檢測結果表明,pET-28a-VP2a蛋白能夠與ADV陽性血清發(fā)生特異性反應。?利用檸檬酸三鈉還原法制備不同直徑大小的膠體金顆粒,確定直徑30 nm的膠體金顆粒用于標記蛋白。根據(jù)膠體金免疫層析的原理,本實驗用膠體金標記純化后的VP2a蛋白作為金標墊,純化后的VP2a蛋白作為NC膜上檢測線(T)的劃線抗原,純化的ADV陽性血清IgG作為NC膜上質控線(C)的劃線抗體。通過優(yōu)化各反應條件,確定金標蛋白最佳標記濃度為10μg/mL,最佳標記pH為8.69,T線抗原濃度為0.7 mg/mL,C線抗體濃度為0.9 mg/mL。試紙條特異性、敏感性、重復性和穩(wěn)定性檢測結果表明,本研究所研制的試紙條能與水貂ADV陽性血清發(fā)生特異性反應,與水貂犬瘟熱、細小病毒性腸炎、圓環(huán)病毒陽性血清不反應,與對流免疫電泳的符合率可達92.9%。
【學位單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.92
【部分圖文】：

懸浮物轉移到的底部有可開閉出將還留在管壁上的填料沖洗出并收集流出液。用 5 mL 清洗脫液洗脫組氨酸標簽蛋白，重濃度。集到的所有流出液。S 進行 50 倍稀釋，用超微量快8a-VP2a PCR 鑒定質粒 pET-28a-VP2a 為模板擴增大小約 705 bp 相符的目的條帶

經瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到約 705 bp 目的基因片段和約 5369 bp 的載體片段，與預期結果相符，結果如圖1-2。圖 1-2 重組質粒 pET-28a-VP2a 的酶切鑒定M：DL15000DNA 相對分子質量標準；1：酶切產物Fig.1-2 Idention of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionenzyme digestionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige1.3.3 表達 pET-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 檢測圖 1-3 中 3～8 為誘導 2～7h 的結果，可以看出在重組表達載體在誘導 4 h時蛋白量表達量最多。圖 1-4 中 2～7 為 IPTG 濃度分別為 0.2 mmol／L、0.4 mmol／L、0.6 mmol／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L 下誘導 5 h 蛋白表達量，可以看出 IPTG 終濃度為 0.8 mmol／L 時蛋白表達量最多，因此pET-28a-VP2a 蛋白誘導最佳條件為 0.8 mmol／L 的 IPTG 誘導 4 h 的蛋白表達量，其大小與預期結果約為 28 KD 相符。圖 1-3 pET-28a-VP2a 在 BL21 中的表達M：低分子量蛋白標準；1：誘導前；2：空載體 pET-28a（+）；3～8：pET-28aVP2a 在 BL21（DE3）中誘導 2～7h 的表達結果Fig.1-3 Expression of pET-28a-VP2a in BL21（DE3）M: Low molecula

圖 1-2 重組質粒 pET-28a-VP2a 的酶切鑒定M：DL15000DNA 相對分子質量標準；1：酶切產物 of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 檢測～8 為誘導 2～7h 的結果，可以看出在重組表達最多。圖 1-4 中 2～7 為 IPTG 濃度分別為 0.2 mm／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L看出 IPTG 終濃度為 0.8 mmol／L 時蛋白表白誘導最佳條件為 0.8 mmol／L 的 IPTG 誘導 4果約為 28 KD 相符。
【參考文獻】

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本文編號：2883549