發(fā)布時間：2020-11-12 22:23

　　 牛作為重要的經(jīng)濟動物,其多能性干細胞具有廣闊的應(yīng)用價值,是具有重要研究意義的生物材料,如用于基因工程、胚胎工程和克隆技術(shù)研究等方面。盡管經(jīng)過了很多的嘗試,到目前為止,仍然沒能有效建立牛的多能干細胞系。最近,有研究報道了從人的皮膚成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞中分離到一種新的干細胞類型,命名為Muse細胞,它具有自我更新和多向分化的潛能,可以向三胚層細胞分化,展現(xiàn)了一定程度的多能性。本研究嘗試利用免疫磁珠分選技術(shù)和酶消化法從牛的胎兒成纖維細胞中分離這種具有一定多能性的Muse細胞,為進一步研究牛的干細胞的分化、基因調(diào)控以及重編程提供細胞模型。研究內(nèi)容如下:1.利用SSEA4作為標記免疫磁珠法分選牛皮膚源Muse細胞通過免疫熒光染色證實牛胎兒成纖維細胞中存在少量表達SSEA4的細胞,利用SSEA4免疫磁珠抗體進行分選,從牛胎兒成纖維細胞中分選出約2?3%的SSEA4陽性細胞。陽性細胞呈三角或多角形,較小,具有較高的核質(zhì)比。檢測結(jié)果顯示其表達堿性磷酸酶(AP)、Oct4、Nanog、Sox2、SSEA4等多能性相關(guān)標記物并能向三胚層細胞分化,但裸鼠實驗不能形成畸胎瘤。此外,SSEA4陽性細胞還表達CD105和其它間質(zhì)細胞的標記,也能夠向脂肪、骨和軟骨細胞分化。2.胰酶消化法分離牛皮膚源Muse細胞對0.25%胰酶/EDTA應(yīng)激處理牛胎兒成纖維細胞獲得Muse細胞進行了探索,結(jié)果表明隨著處理時間的增加,細胞的多能性相關(guān)標記表達不斷增強,處理12 h所獲得的Muse細胞最強;處理12 h獲得的Muse細胞極少,貼壁后呈圓形、三角或多角形,并對其進行了培養(yǎng)。經(jīng)過檢測,Muse細胞表達AP、Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc以及SSEA4等多能性標記,但端粒酶活性較低,也具有向三胚層分化的能力,裸鼠實驗也不能形成畸胎瘤。通過透射電鏡和WB檢測,胰酶應(yīng)激處理過程中存在自噬的發(fā)生,并且隨著處理時間的增加,LC3的表達量逐漸增加。3.Muse細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化通過比較4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL濃度的bFGF對于Muse細胞增殖的影響及多能性的影響,發(fā)現(xiàn)高濃度的bFGF(10ng/mL以上)對Muse細胞的增殖有明顯的促進作用,BrdU摻入實驗也證明20 ng/mL和40 ng/mL的濃度效果較好;AP染色和QRT-PCR結(jié)果表明40 ng/mL的bFGF更有利于提高Muse細胞多能性相關(guān)標記物的表達水平。對Muse細胞進行了懸浮培養(yǎng),超低吸附皿形成的細胞球大小不均勻,容易發(fā)生融合,而且成本較高,采用甲基纖維素懸浮培養(yǎng)在PolyHEMA包被的培養(yǎng)板中形成的細胞球更加均一,此外,經(jīng)過檢測,甲基纖維素懸浮培養(yǎng)有利于進一步純化Muse細胞和維持其未分化狀態(tài),可以作為Muse細胞長期培養(yǎng)的方法。4.Muse細胞核移植胚胎體外發(fā)育潛能的研究用SSEA4+細胞、SSEA4-細胞以及胎兒成纖維細胞作為核供體細胞進行了核移植試驗,結(jié)果顯示,SSEA4+組的克隆胚胎的卵裂率為85.62%,顯著高于SSEA4-組的66.32%和對照組的70.36%;SSEA4+組第7 d克隆囊胚率為40.16%,也顯著高于SSEA4-組的27.42%和對照組的32.45%。SSEA4+組囊胚的胚胎細胞總數(shù)、TE細胞數(shù)、ICM細胞數(shù)以及ICM:TE的比值都顯著高于SSEA4-組胚胎。SSEA4+組囊胚的胚胎細胞總數(shù)和ICM:TE的比值也顯著高于對照組胚胎。各組囊胚的質(zhì)量和囊胚的凋亡率的結(jié)果顯示,SSEA4+組囊胚的細胞凋亡率(2.67±0.32%)顯著低于SSEA4-組(3.68±0.37%)和對照組胚胎(3.05±0.43%)。SSEA4+細胞為供體細胞的囊胚質(zhì)量明顯高于SSEA4-細胞和成纖維細胞。SSEA4+細胞作為供體細胞有利于克隆胚胎的體外發(fā)育。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

圖 1-1 皮膚的結(jié)構(gòu)Fig.1-1Structure of the skin(Hsu et al. 2014)2 表皮干細胞的研究進展 哺乳動物皮膚上皮組織主要有由表皮和毛囊等附屬結(jié)構(gòu)包括構(gòu)成，表皮主要是由角

圖 1-2 表皮分化的層級模式和隨機模式Fig.1-2 Hierarchical versus stochastic models of epidermaldifferentiation(Hsu et al. 201目前，用于對 ESCs 鑒定的的標志物較多，包括整合素家族、增殖細胞CNA)、角蛋白（CK）、CD71、P63、Oct4、Nanog 等多個標記物。整合素為一導細胞與細胞外基質(zhì)的黏附的分子家族。ESCs 表面 α6-integrin 及另一個表皮面標志 CD71 來區(qū)分 ESCs、短暫增殖細胞（Transitamplifying cells,TACs）和終

退化期（毛囊退化）和靜止期（休止階段）(Forni et al. 2012)（圖 1-2）。毛囊生之后一直處于生長-退化-靜息的循環(huán)周期之中，而毛囊中的干細胞則要不斷的進行化和靜息。這受到很多發(fā)育相關(guān)的信號通路的影響。毛囊的發(fā)育始于胚胎第 9~11w，的發(fā)育本質(zhì)上與胚胎表皮分層有關(guān)，涉及到一系列的上皮間質(zhì)作用。這個過程發(fā)生有個階段，又稱為頭發(fā)基板形成、毛囊器官發(fā)生和細胞分化(Forni et al. 2012)。毛囊不僅產(chǎn)生毛發(fā)，還是皮膚組織再生的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
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本文編號：2881313