發(fā)布時間：2020-11-12 21:52

　　 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)是引發(fā)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)的病原。RE是一種對禽類危害嚴(yán)重的腫瘤病和免疫抑制病,與馬立克病(MD)和禽白血病(AL)并稱為三種危害禽類的病毒性腫瘤病。在宿主與病原相互作用過程中miRNA起著重要的作用,大多數(shù)miRNA基因位于與腫瘤形成密切相關(guān)的脆弱基因位點,在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著類似腫瘤癌基因或抑癌基因的關(guān)鍵性作用,研究并分析REV感染細(xì)胞內(nèi)源性miRNA對進一步揭示REV致病的分子機理、發(fā)掘細(xì)胞抗REV分子靶標(biāo)具有重要的理論意義與應(yīng)用前景。鑒于此,本研究利用SPF雞人工感染模型,選擇脾臟組織作為研究對象,因為脾臟是雞重要的外周免疫器官,是成熟T、B淋巴細(xì)胞的定居和免疫應(yīng)答場所。采用高通量測序技術(shù)以及qRT-PCR檢測方法,通過鑒定免疫致病相關(guān)的主要差異mRNA和miRNA,初步探討了REV與雞體在miRNA調(diào)控水平上的相互作用。主要研究內(nèi)容如下:1.本研究使用REV-SNV標(biāo)準(zhǔn)株腹腔注射1日齡SPF雛雞。分別在7、14、21、28、35和42dpi采集三種主要的免疫器官(脾臟、胸腺和法氏囊),觀察臨診癥狀、記錄眼觀病變并計算免疫器官指數(shù)。結(jié)果表明,REV感染SPF雞后,與對照組相比,感染組雛雞出現(xiàn)精神萎靡,羽毛凌亂且稀少,食欲減退,體重減輕等癥狀。剖檢見法氏囊和胸腺萎縮、脾臟腫大,同時法氏囊和胸腺指數(shù)下降、脾臟指數(shù)升高。2.根據(jù)REV的gag基因保守序列設(shè)計一條特異性探針及引物,建立了TaqMan探針qRT-PCR檢測方法。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=-3.4171X+41.92,相關(guān)系數(shù)R~2=0.9965;特異性良好,僅能檢測REV,無交叉反應(yīng)現(xiàn)象;敏感性良好,最小檢出模板濃度約為10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;重復(fù)性良好,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于2%。應(yīng)用該方法,對7、14、21、28、35和42dpi脾臟、胸腺和法氏囊的病毒載量與前病毒載量進行檢測,結(jié)果表明,在每個時間點均能檢測到病毒RNA與前病毒DNA。脾臟、胸腺和法氏囊(前)病毒載量整體趨勢一致,均在28dpi檢測到最低的(前)病毒載量。除法氏囊在21dpi檢測到最高的(前)病毒載量外,脾臟和胸腺均在14dpi檢測到最高的(前)病毒載量。3.選取7、14和21dpi的脾臟組織樣品,利用高通量測序技術(shù)對兩組樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,獲得1507個差異mRNA,其涉及先天免疫反應(yīng)(TLR、MAD5、TRIM25)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)(LY6E、CD36、LAG3)、凋亡與自噬(IRF1、PDCD1、WNT5A)和炎癥反應(yīng)(CCL4、TNFRSF18、CDKN2)等。另外模式識別受體、T細(xì)胞受體、JAK-STAT、TNF以及NF-kappa B信號通路等在REV感染期間發(fā)揮重要作用。最后,通過qRT-PCR驗證33個免疫相關(guān)mRNA,其表達(dá)量與測序數(shù)據(jù)呈正相關(guān),在三個時間點的相關(guān)系數(shù)分別為:R~2=0.961、0.9681和0.9467,表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。4.miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果顯示,在7、14和21dpi共獲得63個差異miRNA(30個已知miRNA和30新型miRNA)以及7373個候選靶基因。功能富集分析結(jié)果表明,miRNA在SPF雞的不同生長階段具有重要的生物學(xué)功能并在多種類型的信號通路中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。最后,通過qRT-PCR驗證15個miRNA,其表達(dá)量與測序數(shù)據(jù)呈正相關(guān),在三個時間點的相關(guān)系數(shù)分別為:R~2=0.9384、0.9718和0.9788,表明小RNA測序結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。5.miRNA與mRNA的整合分析結(jié)果顯示,在7、14和21dpi共獲得482個差異靶基因,并預(yù)測到886個已知miRNA-mRNA作用對和580個新型miRNA-mRNA作用對。功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)靶基因顯著富集在免疫相關(guān)的信號通路類別中,如免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長與凋亡、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類別。通過qRT-PCR進一步驗證14對免疫相關(guān)miRNA-mRNA作用對。結(jié)果表明,REV感染后miRNA可以調(diào)控炎性細(xì)胞因子(CCR2、CCR4、CCR8、STAT1)發(fā)生變化,并影響T、B淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)因子(CTLA4、CASP10、RAPGEF4)的表達(dá)。同時,凋亡因子(FOS、JUN、TNFSF6)和腫瘤調(diào)節(jié)因子(MAPK10、TNFRSF13C)的表達(dá)也發(fā)生變化。這些結(jié)果拓寬了對REV感染引起免疫抑制和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生機制的理解,但其具體作用機制尚需進一步研究。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文.3 REV 感染 SPF 雞脾臟轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建測序流程7 日齡組（INF1-1、INF1-2、INF1-3、CON1-1、CON1-2、CON1-3）、14 日齡組（ININF2-2、INF2-3、CON2-1、CON2-2、CON2-3）和 21 日齡組（INF3-1、INF3-2、ININF3-4、CON1-1、CON1-2、CON1-3）共計 19 個脾臟樣品進行高通量測序。具體如圖 1 所示：

20圖 2 Tophat 分析原理Fig.2 Tophat analysis principlemRNA 表達(dá)量分析（1） 表達(dá)定量：使用 HTSeq 0.6.1p2（http://www.huber.embl.de/users/anders/HTSeq）統(tǒng)計比對到每一個基因上 Read Count值，作為基因的原始表達(dá)量。統(tǒng)計方法如圖 3 所示：首先讀取基因結(jié)構(gòu)注釋信息，然后將比對結(jié)果與基因結(jié)構(gòu)進行比較并統(tǒng)計結(jié)果。

圖 3 Read Count 統(tǒng)計模式圖Fig.3 Read Count statistical mode diagram標(biāo)準(zhǔn)化：由于不同樣品過濾后獲得的數(shù)據(jù)量不可能差異。為了能夠在樣品內(nèi)（不同基因）以及樣品間（用 RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）即堿基長度的 Reads 數(shù)目對表達(dá)量進行標(biāo)準(zhǔn)化（Normal圖 4 RPKM 計算公式Fig.4 RPKM calculation formula達(dá)量的測序質(zhì)量評估：通過以下 5 種方式對測序質(zhì) RPKM 密度分布整體考察樣品的基因表達(dá)模式。2
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉建良;;轉(zhuǎn)移因子對SPF雞巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響[J];福建畜牧獸醫(yī);2018年02期

2 吳慶華;SPF雞的飼養(yǎng)與雞場的管理[J];實驗動物科學(xué)與管理;2004年04期

3 亓麗紅;劉濤;李霞;孫曉軍;張世棟;王友令;李桂明;程克鑫;艾武;;我國SPF雞的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略研究[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年06期

4 李恩擴;陳雪鋒;孔斌;胡敬東;;SPF雛雞感染REV后IL-2 mRNA表達(dá)的動態(tài)變化[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2013年01期

5 南錫,夏長友,陳洪巖;SPF種雞群的培育[J];實驗動物科學(xué)與管理;2003年S1期

6 林歡;韓凌霞;趙麗麗;陳洪巖;;SPF雞微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)[J];實驗動物科學(xué);2017年01期

7 厲從志,梁洪宇;輻照飼料在SPF雞飼養(yǎng)中的使用結(jié)果[J];上海實驗動物科學(xué);2000年02期

8 王友令;袁小遠(yuǎn);孟凱;徐懷英;張玉霞;李莉;亓麗紅;宋敏訓(xùn);艾武;;不同白油佐劑制備的H9N2滅活疫苗在SPF雞上的免疫效果初試驗[J];山東畜牧獸醫(yī);2018年02期

9 路建彪;李玉保;佘銳萍;司振書;段世豪;殷國政;;復(fù)方中藥對SPF雞血清抗體消長規(guī)律的影響[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2018年21期

10 夏長友,楊彬,張德明,陳洪巖;幾種消毒方法對SPF雞培育室消毒效果評價[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);1998年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 徐世文;三氧化二砷抗雞MD腫瘤效應(yīng)及其機理的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

2 朱瑞良;雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株細(xì)胞克隆化毒在回雞過程中致病性與VP2基因變異比較[D];揚州大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 高朔;禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染SPF雞脾臟mRNA與miRNA表達(dá)規(guī)律的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 王麗媛;大蒜素改善禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染SPF雞免疫功能的機制[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 李海燕;樺褐孔菌發(fā)酵物對SPF雞生長性能和免疫性能的影響[D];河北工程大學(xué);2018年

4 何瑩;H4亞型禽流感病毒的分離鑒定與遺傳進化及其對SPF雞致病性的研究[D];廣西大學(xué);2017年

5 柳洪潔;雞消化道正常菌群生態(tài)平衡的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 毛貴林;乳酸桿菌對仔雞營養(yǎng)物質(zhì)代謝與肌肉成分的影響[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

7 董春麗;重組雞γ-干擾素對雞免疫功能影響的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 陳雪鋒;REV感染SPF雞中IL-6、IL-18和IFN-γ的定量檢測[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 高璐;MPAIV與較低致病性禽源E.coli的協(xié)同致病作用及不同感染途徑對MPAIV致病性的影響[D];揚州大學(xué);2005年

10 劉兵;SPF雞與BALB/c小鼠體內(nèi)流感病毒唾液酸受體組織分布的差異性分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

本文編號：2881283