發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 21:08

　　 抗菌肽是一類(lèi)具有生物活性的小分子多肽,具有廣譜的抗菌活性且不易引起細(xì)菌的耐藥性,因其獨(dú)特的抑菌機(jī)制,未來(lái)可能成為一種新型的抗菌藥物。防御素是人體中一類(lèi)重要的抗菌肽,根據(jù)結(jié)構(gòu)可將其分為α和p防御素。人的防御素4(HNP4)是一種由DEFA4基因編碼的α類(lèi)型的防御素,成熟的HNP4由33個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為3.7 kD。HNP4具有高效的抑菌活性,其抗大腸桿菌的活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的100倍左右,對(duì)鏈球菌和白色念珠菌的抗菌活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的4倍左右,另外HNP4還可以抵抗HIV及HSV等病毒的感染。利用動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白是一種具有應(yīng)用前景的技術(shù)。雞的輸卵管生物反應(yīng)器是理想的動(dòng)物生物反應(yīng)器之一,其優(yōu)點(diǎn)在于表達(dá)的外源蛋白能夠分泌到蛋清中,可避免對(duì)雞本身造成傷害,同時(shí)蛋清成分簡(jiǎn)單,便于后期的純化。但是雞的生殖系統(tǒng)較特殊,雞胚的發(fā)育在蛋殼內(nèi)進(jìn)行,這些特點(diǎn)使得制備轉(zhuǎn)基因雞較困難。目前利用慢病毒和PGCs制備轉(zhuǎn)基因雞被認(rèn)為是最可行的兩種方法,但因外源基因的生殖傳遞效率較低,使得制備轉(zhuǎn)基因雞的技術(shù)僅在少數(shù)的發(fā)達(dá)國(guó)家有成功報(bào)道。本課題結(jié)合輸卵管生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì),利用慢病毒制備在輸卵管中特異表達(dá)HNP4的轉(zhuǎn)基因雞。首先克隆了包含激素依賴(lài)性調(diào)控元件(SDRE)和負(fù)調(diào)控元件(NRE)的2.8 kb卵清蛋白啟動(dòng)子(Ova),并在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了該啟動(dòng)子的生物活性。同時(shí),通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得了5’端帶有雞溶菌酶信號(hào)肽序列并經(jīng)過(guò)雞密碼子優(yōu)化的HNP4序列,進(jìn)而構(gòu)建了利用ova啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HNP4基因表達(dá)的載體(pWPXL-Ova-HNP4和pWPXL-Ova-HNP4-His),并將其包裝成相應(yīng)的慢病毒。將慢病毒載體注射到自來(lái)航雞胚的胚盤(pán)(X期)下腔中以制備轉(zhuǎn)基因雞,共注射了669個(gè)雞胚,孵化得到了218只小雞,孵化率為32.6%。將10只G0代生殖嵌合的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配,在1274只后代中,鑒定得到了15只G1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雞,生殖傳遞效率為0.6%～3.4%。Southern blot和Genome Walking結(jié)果顯示G1代轉(zhuǎn)基因雞具有6個(gè)不同的插入位點(diǎn),即單拷貝的HNP4分別插入到了雞的1,2,3,4,6以及24號(hào)染色體中。對(duì)G1和G2代轉(zhuǎn)基因雞進(jìn)行RT-PCR和免疫熒光分析,結(jié)果表明HNP4在G1和G2代雞的輸卵管組織中特異表達(dá),而且ELISA檢測(cè)的結(jié)果表明HNP4在G1和G2代轉(zhuǎn)基因雜合體雞蛋清中的表達(dá)量為1.65 μg/mL～10.18 μg/mL,不同插入位點(diǎn)的HNP4基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平存在顯著差異。綜上所述,本論文成功制備了能夠在蛋清中表達(dá)HNP4的轉(zhuǎn)基因雞,且外源基因HNP4能夠在G1和G2代轉(zhuǎn)基因雞中穩(wěn)定表達(dá),這一研究成果為利用輸卵管反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白奠定良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：Q51
【部分圖文】：

然后進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，在細(xì)菌內(nèi)部進(jìn)一步積累（Ｐａ化ｅｔａｌ．，２０００）。關(guān)于抗菌膚是如何??吸附到細(xì)菌膜上，一種解釋是由于抗菌狀自身帶有正電荷，沒(méi)些帶有正電荷的抗菌化能夠通過(guò)??電荷的作用與細(xì)菌膜上的負(fù)電位相互作用。在研究眾多抗菌狀對(duì)膜的作用機(jī)制時(shí)，抗菌化對(duì)細(xì)??菌胞膜具體破壞方式又可Ｗ細(xì)分為４種方式，分別是聚集型模式（ａｇｇｒｅｇａｔｅ?ｃｈａｎｎｅｌ?ｍｏｄｅｌ），木??桶型模式（ｂａｒｒｅｌ－ｓｔａｖｅ?ｍｏｄｅｌ），地毯型模式（ｃａｒｐｅｔ－ｌｉｋｅ?ｍｏｄｅｌ）?Ｗ及環(huán)孔模式（ｔｏｒｏｉｄａｌ?ｍｏｄｅｌ）。??聚集型模式??聚集型模式主要是抗菌肢與細(xì)菌膜作用時(shí)，先與細(xì)菌的包膜形成相應(yīng)的復(fù)合物，隨著聚集??的抗菌膚的増多，巧菌化與膜形成的復(fù)合物也會(huì)變得越來(lái)越大，當(dāng)細(xì)胞膜受到的張為達(dá)到一定??極限時(shí)就會(huì)遭到破壞．而破壞后抗菌化就可Ｗ直接進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部．最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡（Ｗｕ?ｅｔ??ａｌ．，１９９９）。??木桶模式??木桶模式描述的是抗菌化的疏水性表面與膜的脂質(zhì)核屯、（ｔｈｅ?ｌｉｐｉｄ?ｃｏｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｅｍｂｒａｎｅ）進(jìn)??行相互作用，形成跨膜通道。運(yùn)個(gè)跨膜通道的形成包含Ｗ下幾個(gè)過(guò)程．首先是抗菌化的單體??（ｐｅｐｔｉｄｅ?ｍｏｎｏｍｅｒｓ）?Ｗ螺旋狀的形式進(jìn)入細(xì)菌膜的疏水核屯、部位，隨著抗菌化的數(shù)量增加，抗??菌化與細(xì)菌膜形成的孔徑就越來(lái)越大．最終造成細(xì)菌膜內(nèi)外的滲透壓和酸堿平衡遭到破壞，導(dǎo)??致細(xì)菌死亡個(gè)?１－２）?（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔａｌ＂?２００４）。??

中巧農(nóng)叱大學(xué)巧丄－學(xué)位論文?第一章文獻(xiàn)綜述??細(xì)胞膜疏水中必靠拔形成一個(gè)口徑，從而使碟脂分子層向兩側(cè)彎曲形成一個(gè)環(huán)孔。像蜂毒素，爪??檐素從及ＬＬ３７這些抗菌肋都是從泣種機(jī)制進(jìn)行殺菌的（Ｊｅｎｓｓｅｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００６）。??地毯式模式??在這種模式中，抗菌肋首先大量的平鋪到細(xì)菌胞膜的周?chē)�，但并不直接伸入到膜的�?nèi)部，??而是抗菌肋單體優(yōu)先結(jié)合到磯脂頭部的基團(tuán)，抗菌狀的親水性表面會(huì)朝向隣脂的頭部基團(tuán)，導(dǎo)??致親水性殘基的方向得＾以改變（圖１－３），最終將細(xì)菌的包膜破壞導(dǎo)致細(xì)菌死亡（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔ?ａｌ．，??２００４）。??

且在感染和發(fā)炎的狀態(tài)中Ｐ防御素表達(dá)都會(huì)明顯上升。??還發(fā)現(xiàn)ＨＢＤ－１．?ＨＢＤ－２，?ＨＢＤ－３還可通過(guò)直接結(jié)合到趨化因子ＣＣＲ６受體上來(lái)誘導(dǎo)Ｔ??成熟樹(shù)突細(xì)胞趨化作用（Ｙａｎｇ?ｅｔａｌ．，１９９９）。另外在肥大細(xì)胞中，ＨＢＤ－２還可Ｗ通過(guò)百??和磯脂酶－Ｃ信號(hào)通路誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的降解和遷移（Ｎｉｙｏｎｓ化ａ?ｅｔ?ａ］．，２００２）。??素是人類(lèi)先天性免疫系統(tǒng)的一部分，在防止病原微生物進(jìn)入機(jī)體時(shí)候發(fā)揮著重要的作??ａ防御素ＨＮＰ１，ＨＮＰ２和ＨＮＰ３能夠抑制腺病毒巧郭頭腺瘤病毒（ＨＰＶ）。除此之外，Ｐ??能夠通過(guò)多種途徑來(lái)抑制病毒的傳染，如破壞病毒的包膜Ｗ抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和干??入細(xì)胞后進(jìn)行的病毒復(fù)制通路等（Ｋｌｏｔｍａｎ?ａｎｄ?Ｃｈａｎｇ，?２００６）。體外實(shí)驗(yàn)證明ＨＢＤ－３能??毒的復(fù)制，ＨＢＤ－２能夠有效的抑制大腸桿菌（Ｊｉａｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。一個(gè)有意思的現(xiàn)象是當(dāng)??皮膚病的時(shí)候，防御素的濃度不會(huì)在體內(nèi)增加，只有當(dāng)皮膚感染或者發(fā)炎的時(shí)候，防??量才會(huì)增加（Ｒｉｓｓｏ．?２０００）。??素還具有抗病毒功能，為了應(yīng)對(duì)病毒感染，鉛細(xì)胞一般都會(huì)分泌一些細(xì)胞因子，趨化??其他抗病毒因子Ｗ控制病毒的感染，而一些細(xì)胞因子能夠引起人的先天性免疫系統(tǒng)Ｗ??的感染。研巧表明ＨＩＶ－１能夠促進(jìn)ＨＢＤ－２和ＨＢＤ－３?ｍＲＮＡ的表達(dá)，但是不能夠提高??的表達(dá)。但是病毒是如何刺激鞭細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的防御素，恩個(gè)機(jī)制目前尚不清楚??ｅｓ－Ｍａｔｅｕｅｔａｌ．，２０犯）。因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)邸細(xì)胞缺少病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體，如ＣＤ４，?ＣＣ－趨化??（ＣＣＲ５）?Ｗ及ＣＸＣ趨化因子受體４（ＣＸＣＲ４），但是誘導(dǎo)的模式已經(jīng)清楚（圖１－１０）。??？?

本文編號(hào)：2881245