發(fā)布時間：2020-11-12 21:08

　　 抗菌肽是一類具有生物活性的小分子多肽,具有廣譜的抗菌活性且不易引起細菌的耐藥性,因其獨特的抑菌機制,未來可能成為一種新型的抗菌藥物。防御素是人體中一類重要的抗菌肽,根據(jù)結構可將其分為α和p防御素。人的防御素4(HNP4)是一種由DEFA4基因編碼的α類型的防御素,成熟的HNP4由33個氨基酸殘基組成,分子量約為3.7 kD。HNP4具有高效的抑菌活性,其抗大腸桿菌的活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的100倍左右,對鏈球菌和白色念珠菌的抗菌活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的4倍左右,另外HNP4還可以抵抗HIV及HSV等病毒的感染。利用動物生物反應器生產重組蛋白是一種具有應用前景的技術。雞的輸卵管生物反應器是理想的動物生物反應器之一,其優(yōu)點在于表達的外源蛋白能夠分泌到蛋清中,可避免對雞本身造成傷害,同時蛋清成分簡單,便于后期的純化。但是雞的生殖系統(tǒng)較特殊,雞胚的發(fā)育在蛋殼內進行,這些特點使得制備轉基因雞較困難。目前利用慢病毒和PGCs制備轉基因雞被認為是最可行的兩種方法,但因外源基因的生殖傳遞效率較低,使得制備轉基因雞的技術僅在少數(shù)的發(fā)達國家有成功報道。本課題結合輸卵管生物反應器的優(yōu)勢,利用慢病毒制備在輸卵管中特異表達HNP4的轉基因雞。首先克隆了包含激素依賴性調控元件(SDRE)和負調控元件(NRE)的2.8 kb卵清蛋白啟動子(Ova),并在細胞水平上驗證了該啟動子的生物活性。同時,通過化學合成的方法獲得了5’端帶有雞溶菌酶信號肽序列并經過雞密碼子優(yōu)化的HNP4序列,進而構建了利用ova啟動子驅動HNP4基因表達的載體(pWPXL-Ova-HNP4和pWPXL-Ova-HNP4-His),并將其包裝成相應的慢病毒。將慢病毒載體注射到自來航雞胚的胚盤(X期)下腔中以制備轉基因雞,共注射了669個雞胚,孵化得到了218只小雞,孵化率為32.6%。將10只G0代生殖嵌合的公雞與非轉基因母雞交配,在1274只后代中,鑒定得到了15只G1代轉基因陽性雞,生殖傳遞效率為0.6%～3.4%。Southern blot和Genome Walking結果顯示G1代轉基因雞具有6個不同的插入位點,即單拷貝的HNP4分別插入到了雞的1,2,3,4,6以及24號染色體中。對G1和G2代轉基因雞進行RT-PCR和免疫熒光分析,結果表明HNP4在G1和G2代雞的輸卵管組織中特異表達,而且ELISA檢測的結果表明HNP4在G1和G2代轉基因雜合體雞蛋清中的表達量為1.65 μg/mL～10.18 μg/mL,不同插入位點的HNP4基因在轉錄和翻譯水平存在顯著差異。綜上所述,本論文成功制備了能夠在蛋清中表達HNP4的轉基因雞,且外源基因HNP4能夠在G1和G2代轉基因雞中穩(wěn)定表達,這一研究成果為利用輸卵管反應器生產藥物蛋白奠定良好的基礎。
【學位單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q51
【部分圖文】：

然后進入細菌內部，在細菌內部進一步積累（Ｐａ化ｅｔａｌ．，２０００）。關于抗菌膚是如何??吸附到細菌膜上，一種解釋是由于抗菌狀自身帶有正電荷，沒些帶有正電荷的抗菌化能夠通過??電荷的作用與細菌膜上的負電位相互作用。在研究眾多抗菌狀對膜的作用機制時，抗菌化對細??菌胞膜具體破壞方式又可Ｗ細分為４種方式，分別是聚集型模式（ａｇｇｒｅｇａｔｅ?ｃｈａｎｎｅｌ?ｍｏｄｅｌ），木??桶型模式（ｂａｒｒｅｌ－ｓｔａｖｅ?ｍｏｄｅｌ），地毯型模式（ｃａｒｐｅｔ－ｌｉｋｅ?ｍｏｄｅｌ）?Ｗ及環(huán)孔模式（ｔｏｒｏｉｄａｌ?ｍｏｄｅｌ）。??聚集型模式??聚集型模式主要是抗菌肢與細菌膜作用時，先與細菌的包膜形成相應的復合物，隨著聚集??的抗菌膚的増多，巧菌化與膜形成的復合物也會變得越來越大，當細胞膜受到的張為達到一定??極限時就會遭到破壞．而破壞后抗菌化就可Ｗ直接進入細菌內部．最終導致細菌的死亡（Ｗｕ?ｅｔ??ａｌ．，１９９９）。??木桶模式??木桶模式描述的是抗菌化的疏水性表面與膜的脂質核屯、（ｔｈｅ?ｌｉｐｉｄ?ｃｏｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｅｍｂｒａｎｅ）進??行相互作用，形成跨膜通道。運個跨膜通道的形成包含Ｗ下幾個過程．首先是抗菌化的單體??（ｐｅｐｔｉｄｅ?ｍｏｎｏｍｅｒｓ）?Ｗ螺旋狀的形式進入細菌膜的疏水核屯、部位，隨著抗菌化的數(shù)量增加，抗??菌化與細菌膜形成的孔徑就越來越大．最終造成細菌膜內外的滲透壓和酸堿平衡遭到破壞，導??致細菌死亡個?１－２）?（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔａｌ＂?２００４）。??

中巧農叱大學巧丄－學位論文?第一章文獻綜述??細胞膜疏水中必靠拔形成一個口徑，從而使碟脂分子層向兩側彎曲形成一個環(huán)孔。像蜂毒素，爪??檐素從及ＬＬ３７這些抗菌肋都是從泣種機制進行殺菌的（Ｊｅｎｓｓｅｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００６）。??地毯式模式??在這種模式中，抗菌肋首先大量的平鋪到細菌胞膜的周圍，但并不直接伸入到膜的內部，??而是抗菌肋單體優(yōu)先結合到磯脂頭部的基團，抗菌狀的親水性表面會朝向隣脂的頭部基團，導??致親水性殘基的方向得＾以改變（圖１－３），最終將細菌的包膜破壞導致細菌死亡（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔ?ａｌ．，??２００４）。??

且在感染和發(fā)炎的狀態(tài)中Ｐ防御素表達都會明顯上升。??還發(fā)現(xiàn)ＨＢＤ－１．?ＨＢＤ－２，?ＨＢＤ－３還可通過直接結合到趨化因子ＣＣＲ６受體上來誘導Ｔ??成熟樹突細胞趨化作用（Ｙａｎｇ?ｅｔａｌ．，１９９９）。另外在肥大細胞中，ＨＢＤ－２還可Ｗ通過百??和磯脂酶－Ｃ信號通路誘導肥大細胞的降解和遷移（Ｎｉｙｏｎｓ化ａ?ｅｔ?ａ］．，２００２）。??素是人類先天性免疫系統(tǒng)的一部分，在防止病原微生物進入機體時候發(fā)揮著重要的作??ａ防御素ＨＮＰ１，ＨＮＰ２和ＨＮＰ３能夠抑制腺病毒巧郭頭腺瘤病毒（ＨＰＶ）。除此之外，Ｐ??能夠通過多種途徑來抑制病毒的傳染，如破壞病毒的包膜Ｗ抑制病毒進入細胞內和干??入細胞后進行的病毒復制通路等（Ｋｌｏｔｍａｎ?ａｎｄ?Ｃｈａｎｇ，?２００６）。體外實驗證明ＨＢＤ－３能??毒的復制，ＨＢＤ－２能夠有效的抑制大腸桿菌（Ｊｉａｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。一個有意思的現(xiàn)象是當??皮膚病的時候，防御素的濃度不會在體內增加，只有當皮膚感染或者發(fā)炎的時候，防??量才會增加（Ｒｉｓｓｏ．?２０００）。??素還具有抗病毒功能，為了應對病毒感染，鉛細胞一般都會分泌一些細胞因子，趨化??其他抗病毒因子Ｗ控制病毒的感染，而一些細胞因子能夠引起人的先天性免疫系統(tǒng)Ｗ??的感染。研巧表明ＨＩＶ－１能夠促進ＨＢＤ－２和ＨＢＤ－３?ｍＲＮＡ的表達，但是不能夠提高??的表達。但是病毒是如何刺激鞭細胞誘導產生相應的防御素，恩個機制目前尚不清楚??ｅｓ－Ｍａｔｅｕｅｔａｌ．，２０犯）。因為研究發(fā)現(xiàn)邸細胞缺少病毒進入細胞的受體，如ＣＤ４，?ＣＣ－趨化??（ＣＣＲ５）?Ｗ及ＣＸＣ趨化因子受體４（ＣＸＣＲ４），但是誘導的模式已經清楚（圖１－１０）。??？?

本文編號：2881245