發(fā)布時間：2020-11-11 12:26

　　 東方次睪吸蟲(Metorchis orientalis)寄生于雞、鴨等禽類、野生鳥類及犬、貓、人等哺乳動物的膽囊和膽管內(nèi),造成肝膽損傷及功能障礙,嚴重者可引起死亡。由于東方次睪吸蟲與華支睪吸蟲的囊蚴形態(tài)相似,流行區(qū)域和中間宿主相同,寄生部位和臨床癥狀亦相似,容易被誤判為華支睪吸蟲病。因此,東方次睪吸蟲很可能是一種被忽視的重要人獸共患病原。東方次睪吸蟲主要分布于亞洲,在我國多省有報道,福建、安徽和黑龍江等省為主要流行區(qū)。近幾年東方次睪吸蟲病的感染率逐年增高,對畜牧業(yè)和社會公共安全造成了極大的威脅。目前對東方次睪吸蟲的研究工作主要集中在形態(tài)學(xué)、生活史、試驗動物感染、流行病學(xué)調(diào)查、治療和分子分類等方面,國內(nèi)外關(guān)于東方次睪吸蟲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組以及免疫診斷的相關(guān)研究還未見報道,影響了對東方次睪吸蟲致病機制的深入研究和防治工作。因此,本研究擬對東方次睪吸蟲的成蟲、囊蚴和蟲卵三個發(fā)育階段進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,通過對三個發(fā)育階段東方次睪吸蟲在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上的差異分析,揭示東方次睪吸蟲不同發(fā)育階段的生物學(xué)特征和代謝特征。根據(jù)組學(xué)分析結(jié)果篩選出東方次睪吸蟲的診斷候選基因進行重組表達和免疫原性鑒定,建立東方次睪吸蟲病間接ELISA診斷方法。主要研究結(jié)果如下:1.通過對東方次睪吸蟲成蟲、囊蚴和蟲卵三個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序,拼接獲得不同發(fā)育期東方次睪吸蟲Unigenes共199,723個,平均長度1,012核苷酸,N50值為1,396。共有91,398個Unigenes與已知數(shù)據(jù)庫匹配,其中包括Nr(76,247,38.17%)、Nt(34,046,17.04%)、KOG(23,640,11.83%)、KEGG(19,141,9.58%)、Swiss-Prot(35,633,17.84%)、GO(50,577,25.32%)和Pfam(50,449,25.25%)數(shù)據(jù)庫。三個發(fā)育時期共鑒定到23,071個差異表達基因,在成蟲和囊蚴之間共有13,823個,在成蟲和蟲卵之間共有10,343個,在蟲卵和囊蚴之間共有18,348個。對差異表達基因進行GO分析,發(fā)現(xiàn)除了基礎(chǔ)代謝過程外,成蟲階段差異表達基因主要富集在微管合成、蛋白代謝和生殖行為等過程;囊蚴階段差異表達基因主要富集在幼蟲發(fā)育、胚胎發(fā)育和核分裂等過程;蟲卵階段差異表達基因主要富集在大分子復(fù)合物組裝、神經(jīng)元發(fā)育和細胞骨架等過程。KEGG分析發(fā)現(xiàn)了與肝臟纖維化相關(guān)的TGF-β信號通路。利用qPCR方法對三個發(fā)育階段的差異表達基因進行了驗證,結(jié)果各基因的表達趨勢均與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。2.通過對東方次睪吸蟲成蟲、囊蚴和蟲卵的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,共鑒定到3,616個蛋白質(zhì),三個發(fā)育時期共鑒定到2,571個差異表達蛋白,成蟲和囊蚴之間共有1,445個差異蛋白,成蟲和蟲卵之間共有1,728個差異蛋白,囊蚴和蟲卵之間共有1,936個差異蛋白,對三個發(fā)育階段的差異蛋白進行GO和KEGG分析,結(jié)果表明在成蟲階段差異蛋白顯著富集在蛋白質(zhì)折疊、肌肉收縮的調(diào)節(jié)和糖酵解等功能,主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)處理、核糖體和間隙連接等信號通路。在蟲卵階段差異蛋白顯著富集在微管運動活化、三磷酸腺苷酶活化和螺旋酶活化等功能,主要參與剪接體、RNA轉(zhuǎn)運和DNA復(fù)制等信號通路。在囊蚴階段差異蛋白顯著富集在磷酸轉(zhuǎn)移酶活化、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活化和烏頭酸水合酶活化等功能,主要參與纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解和甘油酯代謝等信號通路。利用PRM對三個發(fā)育階段中的差異表達蛋白進行驗證,表明PRM結(jié)果與蛋白質(zhì)組測序趨勢一致。在對東方次睪吸蟲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析的基礎(chǔ)上,對兩種組學(xué)分析中的差異表達基因和差異表達蛋白進行數(shù)量、表達量、功能分類和代謝通路的比較關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示兩組學(xué)的差異基因和差異蛋白在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上具有較好的一致性。3.對東方次睪吸蟲的排泄分泌蛋白進行質(zhì)譜分析,共鑒定到392個排泄分泌蛋白,全部關(guān)聯(lián)到轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。依據(jù)排泄分泌蛋白質(zhì)譜結(jié)果結(jié)合兩組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果和前期相關(guān)研究文獻,篩選出7個免疫相關(guān)候選基因,成功地構(gòu)建了候選基因的原核表達載體,并通過western blot對免疫原性進行鑒定。以重組蛋白rMoENO1和r MoCTSF作為抗原,成功建立了東方次睪吸蟲病間接ELISA診斷方法。重組蛋白rMoENO1與rMoCTSF的ELISA診斷方法的敏感性分別為1:1600和1:800,且與鴨球蟲、鴨對體吸蟲、日本棘隙吸蟲、舟形嗜氣管吸蟲和卷棘口吸蟲陽性血清無交叉反應(yīng)。通過對臨床樣品檢測,發(fā)現(xiàn)建立的重組蛋白rMoENO1與rMoCTSF的間接ELISA檢測方法在陽性檢出率上無顯著差異(P0.05),均可用于東方次睪吸蟲病的血清學(xué)診斷。本研究對東方次睪吸蟲三個發(fā)育階段進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)進行測序分析,并建立了東方次睪吸蟲病的ELISA診斷方法,研究結(jié)果可深入了解東方次睪吸蟲不同發(fā)育階段的生命活動特征和調(diào)控機制,為東方次睪吸蟲的致病機制及免疫防治研究提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.735
【部分圖文】：

東方次睪吸蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析及免疫相關(guān)基因鑒定、貓、狗的的感染率分別為 4.2%（4/95），66.7%（4/6），麥穗魚的感染率為 87.6%（244/279）。張鴻滿等[13]報道廣別為 1.7%（2/119）和 2.4%（1/42），魚類感染率為 25.6%河水系，家鴨感染率 17.2%（103/600），麥穗魚的囊蚴平均 0.6%（6/1000）。方彥炎等[15]報道福建省浦城縣，貓、狗1），30.775%（4/13），44.4%（4/9），而麥穗魚的感染率為 6述地區(qū)為東方次睪吸蟲的自然疫源地，都具有以下特點：量多，包括雞、鴨、犬、貓等；二是有江、河、魚塘、池中有大量的紋沼螺；四是居民有吃生的或未煮熟魚的習(xí)慣

第一章 文獻綜述具和籠舍用生石灰水消毒；四是定期檢查糞便，進行預(yù)防性藥物驅(qū)蟲東方次睪吸蟲病就是要摒棄不良的飲食習(xí)慣，不吃生的或者不熟的睪吸蟲病的治療，主要是使用廣譜抗寄生蟲藥物進行驅(qū)蟲，如吡喹酮氯酚等。但盲目驅(qū)蟲會造成藥物的過度使用，不僅造成浪費，而且刺株和在畜禽體內(nèi)的藥物殘留等問題[17-20]。綜上所述，東方次睪吸蟲病主要是缺少針對該病的基礎(chǔ)理論研究，缺乏有效的生前診斷方法和新對該病的研究應(yīng)致力于在探索東方次睪吸蟲生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上，尋法和制定新的防治措施。

圖 2-1 文庫構(gòu)建原理Fig. 2-1 Principle of library building，需要對原始測序序列（raw reads）進據(jù)分析都是在高質(zhì)量的 clean reads 基礎(chǔ)ed 數(shù)值大于 20 的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的堿基數(shù)的百分比）值及 GC 含量（堿基效率評估序列讀長（reads）進行凈化處理，除掉序列，得到 clean reads。通過 Trinity 軟
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2879177