發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 13:39

　　 依據(jù)課題組對(duì)山羊附睪頭和睪丸組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后差異基因分析后發(fā)現(xiàn),山羊β-防御素124(Goatbeta-defensin 124,gDB124)在太行山羊附睪頭組織大量表達(dá),且在附睪頭上皮細(xì)胞游離緣的纖毛層和管腔液有強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào),推測(cè)其可能與精子的成熟及獲能等有關(guān)。但是,目前關(guān)于gDB124與精子成熟間的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本試驗(yàn)將通過(guò)建立gDB124穩(wěn)定沉默細(xì)胞系,為gDB124沉默山羊附睪頭細(xì)胞與未成熟精子共孵育的功能研究及gDB124沉默后下游信號(hào)通路的研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過(guò)胰蛋白酶消化法對(duì)剪碎的太行山羊附睪頭組織進(jìn)行培養(yǎng),建立太行山羊附睪頭細(xì)胞系;構(gòu)建三個(gè)沉默gDB124慢病毒載體,分別為L(zhǎng)V10-gDBB12-51、LV10-gDBB12-104、LV10-gDB124-161:用LV10-NC慢病毒陰性對(duì)照載體對(duì)太行山羊附睪頭細(xì)胞最佳MOI值進(jìn)行篩選;將三個(gè)慢病毒載體以最佳MOI值分別轉(zhuǎn)染太行山羊附睪頭細(xì)胞,通過(guò)熒光觀察和熒光定量檢測(cè)gDB124的mRNA表達(dá)情況,篩選出效率高的慢病毒載體;通過(guò)終濃度為0,1,2.5,5,7.5,10μg/mL嘌呤霉素對(duì)太行山羊附睪頭細(xì)胞進(jìn)行處理,72h后依據(jù)活細(xì)胞數(shù)確認(rèn)嘌呤霉素最低致死終濃度;用嘌呤霉素對(duì)已使用慢病毒沉默gDB124的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行篩選,并進(jìn)行多次傳代培養(yǎng),凍存和復(fù)蘇,建立穩(wěn)定沉默gDB124細(xì)胞系。研究結(jié)果如下:(1)成功建立了太行山羊附睪頭細(xì)胞系,培養(yǎng)的山羊附睪頭細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)整體呈“S”型,符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律,能夠穩(wěn)定傳代,且生長(zhǎng)狀態(tài)良好;(2)構(gòu)建的三個(gè)沉默gDB124慢病毒載體分別為:LV10-gDB124-51、LV10-gDB124-104、LV10-gDB124-161,測(cè)序驗(yàn)證shRNA序列無(wú)誤,經(jīng)過(guò)慢病毒包裝后滴度分別為 1×108TU/mL、3×108TU/mL、1×108TU/mL;(3)LV10-NC慢病毒載體對(duì)太行山羊附睪頭細(xì)胞感染的最適MOI值為1。通過(guò)QRT-PCR篩選出干擾效果最好為L(zhǎng)V10-gDB124-51和LV10-gDB124-161兩種載體等量共轉(zhuǎn)染(P0.0005),沉默效率達(dá)到50%;(4)太行山羊附睪頭細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素處理后細(xì)胞耐受濃度為終濃度1 μg/mL;(5)LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161慢病毒侵染太行山羊附睪頭細(xì)胞后,獲得了能夠穩(wěn)定傳代且表達(dá)熒光的陽(yáng)性細(xì)胞。綜上所述,本研究成功建立了太行山羊附睪頭細(xì)胞系,構(gòu)建了三個(gè)沉默gDB124的慢病毒載體,并且篩選出沉默效率最高的載體,成功建立了穩(wěn)定沉默gDB124細(xì)胞系。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

２結(jié)果與分析??２．１山羊附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果??圖２－１中Ａ圖為組織塊消化后，原代細(xì)胞形態(tài)，可以明顯看出細(xì)胞密度較大，顯然??細(xì)胞剛從組織塊中消化分離出，體積較小，形態(tài)多呈圓形。原代培養(yǎng)Ｉｄ后（圖Ｂ），顯??微鏡下觀察仍然存在部分細(xì)胞團(tuán)，沒(méi)有完全消化，細(xì)胞己經(jīng)處Ｔ貼壁生Ｌ＜：狀態(tài)。閣Ｃ和??圖Ｄ為原代培養(yǎng)８?ｄ后，明顯看出細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)很好，融合度達(dá)到９０％以上，可以看出??還有部分細(xì)胞團(tuán)。??■圓??注：Ａ：附睪頭組織經(jīng)酶消化后獲得的細(xì)胞；原代培養(yǎng)２ｄ；?Ｃ、Ｄ：原代培養(yǎng)８ｄ；??圖２－１山羊附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況（Ｉ０ＵＸ）??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｐｒｅｎｉａｎ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（Ｋ）ＯＸ）??２．２傳代培養(yǎng)結(jié)果??附睪頭細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代細(xì)胞＾Ｌ＜：狀態(tài)仍ｋ好，閣２－２分別為說(shuō)代細(xì)胞傳個(gè)：第??１７??

Ｆｉｇ．?２－２?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（?１００?Ｘ）??２．３山羊附睪頭細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)果??山羊附睪頭細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存、復(fù)蘇后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍良好，圖２－３Ａ圖為細(xì)胞復(fù)蘇??后剛鋪到培養(yǎng)瓶中的狀態(tài)，可以看出細(xì)胞都是圓形，還未貼壁生長(zhǎng)，并沒(méi)有大量細(xì)胞破??１８??

２．４山羊附睪頭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線??根據(jù)埒次記錄的細(xì)胞數(shù)３：，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制山羊附??睪頭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖２－４）。細(xì)胞接種第Ｉｄ，細(xì)胞數(shù)量低于初始接種數(shù)量；從第２－３?ｄ??開(kāi)始，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；從第５?ｄ幵始，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢；從第６?ｄ開(kāi)始，細(xì)胞??進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)果表明，培養(yǎng)的山羊附睪頭細(xì)胞牛長(zhǎng)趨勢(shì)整體呈“Ｓ”型，符合細(xì)胞生長(zhǎng)??規(guī)律。??２０００００－Ｉ??＼—??＾?１５００００－??＃??８??＾?１０００００－??＾?／??ＵＪ?５００００－??〇?＾??０?２?４?６?８?１０??ＤＡＹ??圖２－４山羊附睪頭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線??Ｆｉｇ．?２－４?Ｉ＇ｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｎ?ｃ?ｏｆ?ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ??２．５?ｇＤ萬(wàn)／２ＶｍＲＮＡ在太行山羊附睪頭細(xì)胞中的定位??圖２－５為以在太行山羊附睪頭細(xì)胞中原位雜交的結(jié)果。在熒光倒置顯微鏡下，??１９??
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本文編號(hào)：2879250