依據(jù)課題組對山羊附睪頭和睪丸組織進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序后差異基因分析后發(fā)現(xiàn),山羊β-防御素124(Goatbeta-defensin 124,gDB124)在太行山羊附睪頭組織大量表達,且在附睪頭上皮細胞游離緣的纖毛層和管腔液有強陽性信號,推測其可能與精子的成熟及獲能等有關。但是,目前關于gDB124與精子成熟間的作用機制尚不清楚。因此,本試驗將通過建立gDB124穩(wěn)定沉默細胞系,為gDB124沉默山羊附睪頭細胞與未成熟精子共孵育的功能研究及gDB124沉默后下游信號通路的研究奠定基礎。本試驗通過胰蛋白酶消化法對剪碎的太行山羊附睪頭組織進行培養(yǎng),建立太行山羊附睪頭細胞系;構(gòu)建三個沉默gDB124慢病毒載體,分別為LV10-gDBB12-51、LV10-gDBB12-104、LV10-gDB124-161:用LV10-NC慢病毒陰性對照載體對太行山羊附睪頭細胞最佳MOI值進行篩選;將三個慢病毒載體以最佳MOI值分別轉(zhuǎn)染太行山羊附睪頭細胞,通過熒光觀察和熒光定量檢測gDB124的mRNA表達情況,篩選出效率高的慢病毒載體;通過終濃度為0,1,2.5,5,7.5,10μg/mL嘌呤霉素對太行山羊附睪頭細胞進行處理,72h后依據(jù)活細胞數(shù)確認嘌呤霉素最低致死終濃度;用嘌呤霉素對已使用慢病毒沉默gDB124的陽性細胞進行篩選,并進行多次傳代培養(yǎng),凍存和復蘇,建立穩(wěn)定沉默gDB124細胞系。研究結(jié)果如下:(1)成功建立了太行山羊附睪頭細胞系,培養(yǎng)的山羊附睪頭細胞生長趨勢整體呈“S”型,符合細胞生長規(guī)律,能夠穩(wěn)定傳代,且生長狀態(tài)良好;(2)構(gòu)建的三個沉默gDB124慢病毒載體分別為:LV10-gDB124-51、LV10-gDB124-104、LV10-gDB124-161,測序驗證shRNA序列無誤,經(jīng)過慢病毒包裝后滴度分別為 1×108TU/mL、3×108TU/mL、1×108TU/mL;(3)LV10-NC慢病毒載體對太行山羊附睪頭細胞感染的最適MOI值為1。通過QRT-PCR篩選出干擾效果最好為LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161兩種載體等量共轉(zhuǎn)染(P0.0005),沉默效率達到50%;(4)太行山羊附睪頭細胞對嘌呤霉素處理后細胞耐受濃度為終濃度1 μg/mL;(5)LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161慢病毒侵染太行山羊附睪頭細胞后,獲得了能夠穩(wěn)定傳代且表達熒光的陽性細胞。綜上所述,本研究成功建立了太行山羊附睪頭細胞系,構(gòu)建了三個沉默gDB124的慢病毒載體,并且篩選出沉默效率最高的載體,成功建立了穩(wěn)定沉默gDB124細胞系。
【學位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

２結(jié)果與分析??２．１山羊附睪頭細胞原代培養(yǎng)結(jié)果??圖２－１中Ａ圖為組織塊消化后，原代細胞形態(tài)，可以明顯看出細胞密度較大，顯然??細胞剛從組織塊中消化分離出，體積較小，形態(tài)多呈圓形。原代培養(yǎng)Ｉｄ后（圖Ｂ），顯??微鏡下觀察仍然存在部分細胞團，沒有完全消化，細胞己經(jīng)處Ｔ貼壁生Ｌ＜：狀態(tài)。閣Ｃ和??圖Ｄ為原代培養(yǎng)８?ｄ后，明顯看出細胞生長狀態(tài)很好，融合度達到９０％以上，可以看出??還有部分細胞團。??■圓??注：Ａ：附睪頭組織經(jīng)酶消化后獲得的細胞；原代培養(yǎng)２ｄ；?Ｃ、Ｄ：原代培養(yǎng)８ｄ；??圖２－１山羊附睪頭細胞原代培養(yǎng)生長情況（Ｉ０ＵＸ）??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｐｒｅｎｉａｎ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（Ｋ）ＯＸ）??２．２傳代培養(yǎng)結(jié)果??附睪頭細胞經(jīng)過連續(xù)傳代細胞＾Ｌ＜：狀態(tài)仍ｋ好，閣２－２分別為說代細胞傳個：第??１７??

Ｆｉｇ．?２－２?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（?１００?Ｘ）??２．３山羊附睪頭細胞復蘇培養(yǎng)結(jié)果??山羊附睪頭細胞經(jīng)過凍存、復蘇后，細胞生長狀態(tài)仍良好，圖２－３Ａ圖為細胞復蘇??后剛鋪到培養(yǎng)瓶中的狀態(tài)，可以看出細胞都是圓形，還未貼壁生長，并沒有大量細胞破??１８??

２．４山羊附睪頭細胞生長曲線??根據(jù)埒次記錄的細胞數(shù)３：，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標，繪制山羊附??睪頭細胞生長曲線（圖２－４）。細胞接種第Ｉｄ，細胞數(shù)量低于初始接種數(shù)量；從第２－３?ｄ??開始，細胞進入對數(shù)生長期；從第５?ｄ幵始，細胞生長速度減慢；從第６?ｄ開始，細胞??進入平臺期。結(jié)果表明，培養(yǎng)的山羊附睪頭細胞牛長趨勢整體呈“Ｓ”型，符合細胞生長??規(guī)律。??２０００００－Ｉ??＼—??＾?１５００００－??＃??８??＾?１０００００－??＾?／??ＵＪ?５００００－??〇?＾??０?２?４?６?８?１０??ＤＡＹ??圖２－４山羊附睪頭細胞生長曲線??Ｆｉｇ．?２－４?Ｉ＇ｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｎ?ｃ?ｏｆ?ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ??２．５?ｇＤ萬／２ＶｍＲＮＡ在太行山羊附睪頭細胞中的定位??圖２－５為以在太行山羊附睪頭細胞中原位雜交的結(jié)果。在熒光倒置顯微鏡下，??１９??
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本文編號：2879250