發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 08:21

　　 新霉素(Neomycin,NEO)屬于氨基糖苷類藥物。主要用來(lái)治療畜禽耳炎、皮炎等感染,雞白痢等疫病,還可以預(yù)防動(dòng)物性疾病,并促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,因價(jià)格低廉、效果明顯而在畜牧業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。但長(zhǎng)期使用,或超劑量用藥,能在動(dòng)物組織中沉積、殘留,不僅會(huì)對(duì)動(dòng)物健康造成危害,還會(huì)通過(guò)食物鏈危害消費(fèi)者的健康。其危害性主要包括耳毒性、腎毒性以及神經(jīng)肌肉阻滯現(xiàn)象等。新霉素殘留現(xiàn)有的檢測(cè)方法有微生物檢測(cè)方法、色譜檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法等。在眾多檢測(cè)方法中,微生物法可通過(guò)半定量篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)食物中的獸藥殘留進(jìn)行分析,但無(wú)法定量;薄層色譜法可分離多種物質(zhì)、成本低,但其結(jié)果易受主觀因素影響;高效液相色譜能夠?yàn)樗幋鷦?dòng)力學(xué)研究和其它調(diào)查研究提供所需的檢測(cè)特異性和靈敏度,但需要昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作人員;快速的酶聯(lián)免疫在精確測(cè)定復(fù)雜體系中的新霉素的含量時(shí)非常有用,但操作過(guò)程中需要反復(fù)洗滌及孵育,影響了檢測(cè)時(shí)間和效率。因此,構(gòu)建新霉素簡(jiǎn)單、快速、特異的檢測(cè)方法是一個(gè)熱門研究方向。本論文擬通過(guò)新霉素人工抗原及單克隆抗體制備,結(jié)合熒光偏振技術(shù),建立新霉素的熒光偏振免疫學(xué)檢測(cè)方法。本文主要包含以下幾個(gè)部分:1.新霉素人工抗原的合成與鑒定分析新霉素化學(xué)結(jié)構(gòu),針對(duì)新霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)中的氨基活性基團(tuán),選取牛血清蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)作為載體蛋白,采用戊二醛法制備人工免疫原NEO-BSA和NEO-OVA。通過(guò)紫外掃描、SDS-PAGE電泳進(jìn)行初步鑒定,動(dòng)物免疫對(duì)人工抗原進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。紫外掃描結(jié)果顯示,偶聯(lián)產(chǎn)物與載體蛋白的吸收峰沒(méi)有重疊;SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,載體蛋白的遷移速率比偶聯(lián)產(chǎn)物快,由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)初步判定人工抗原偶聯(lián)成功;NEO-BSA所免疫小鼠的多抗血清效價(jià)都在1:6400以上,半數(shù)抑制濃度(IC50)為27.35ng/m L,表明偶聯(lián)的人工抗原具有良好的免疫原性,且能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)新霉素的特異性抗體。2.新霉素單克隆抗體的制備及鑒定取NEO-BSA免疫的小鼠中血清效價(jià)及靈敏度最高的小鼠的脾細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)將其與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,采用間接酶聯(lián)免疫法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆等一系列篩選實(shí)驗(yàn),篩選出3株能分泌抗新霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1E9、4E8、1G1,經(jīng)測(cè)定細(xì)胞上清效價(jià)均在1:6.4×103以上,選取效價(jià)較高的1E9雜交瘤細(xì)胞株用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水。將得到的單抗進(jìn)行純化,并通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定,判定純化成功。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)抑制,得到線性回歸方程為y=-0.7398x+2.813的標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)R2=0.9948,根據(jù)線性回歸方程可得IC50=1.338ng/m L。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè),與其它氨基糖苷類藥物交叉反應(yīng)率均低于0.01%,發(fā)現(xiàn)與其他藥物均無(wú)交叉。經(jīng)以上試驗(yàn)驗(yàn)證,成功制備了特異性高、靈敏度強(qiáng)的新霉素單克隆抗體,為熒光偏振檢測(cè)方法提供了所需抗體。3.新霉素?zé)晒馄�振檢測(cè)方法的建立將新霉素與熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián),獲得示蹤物,采用TLC進(jìn)行分離純化,分別經(jīng)甲醇及碳酸鹽緩沖液(CBS)萃取后,篩選出與抗體結(jié)合能力最佳的分離條帶,即Rf=0.4由CBS萃取得到的物質(zhì)。優(yōu)化示蹤物及抗體的工作濃度,對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程Y=128.9+53.2/[(1+56.5/x)-1.175],由方程可得IC50為56.5ng/mL,線性范圍為17.37ng/mL-183.92ng/mL,相關(guān)系數(shù)R2=0.9930。4.熒光偏振檢測(cè)方法在檢測(cè)牛奶中新霉素殘留的應(yīng)用對(duì)牛奶的處理方法進(jìn)行優(yōu)化,確定對(duì)牛奶先進(jìn)行稀釋,后采用飽和硫酸銨法沉淀處理牛奶。向牛奶中添加新霉素標(biāo)品,配置成濃度為30ng/mL、50ng/mL、70ng/m L的新霉素牛奶溶液,對(duì)添加過(guò)標(biāo)品的牛奶進(jìn)行處理后,應(yīng)用已建立的熒光偏振檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),回收率為87.91%-114.28%。
【學(xué)位單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S859.84;O657.3
【部分圖文】：

圖 1-1 熒光偏振檢測(cè)原理圖Fig. 1-1 The schematic diagram of FPIA.7 本研究的目的和意義隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了氨基糖苷類抗生素的兩面性，不合理會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，進(jìn)而對(duì)人類健康造成危害，所以應(yīng)嚴(yán)格按照其限量進(jìn)行，并注意休藥期。然而現(xiàn)實(shí)生活中，在利益的驅(qū)使下，超限量使用的情況仍在，這就要求相關(guān)監(jiān)管部門加大對(duì)抗生素類藥物殘留的監(jiān)測(cè)力度。所以為了監(jiān)管部門進(jìn)對(duì)食品中新霉素殘留進(jìn)行快速精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)，確保食品安全性，為廣費(fèi)者提供健康保障，建立完善的快速高效靈敏的新霉素的檢測(cè)技術(shù)已刻不。在眾多檢測(cè)方法中，微生物法可通過(guò)半定量篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)食物中的獸藥殘留分析，但無(wú)法定量；薄層色譜法可分離多種物質(zhì)、成本低，但其結(jié)果易受主素影響；高效液相色譜在藥代動(dòng)力學(xué)研究和其它調(diào)查研究中提供所需要的特和靈敏度，但需要昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作人員；快速的酶聯(lián)免疫在精

算其抑制率 B/B0（B0：新霉素濃度為 0 時(shí)的 OD450，B：新霉素其50），以 B/B0的結(jié)果為縱坐標(biāo)，以新霉素質(zhì)量濃度（ng/mL）的對(duì)，繪制新霉素對(duì)小鼠多抗血清的抑制曲線，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推，計(jì)算多抗血清對(duì)新霉素 50%的抑制濃度（IC50），以其來(lái)衡量多度。結(jié)果與分析新霉素人工抗原的鑒定結(jié)果1）紫外掃描鑒定結(jié)果用 U-3000 紫外掃描儀對(duì) BSA、NEO-BSA、OVA、NEO-OVA 進(jìn) 波長(zhǎng)掃描。由圖 2-1、圖 2-2 可以看出 BSA、OVA 特征吸收峰在 物 NEO-BSA、NEO-OVA 在 268nm 處出現(xiàn)最大吸收峰，與 BSA 最移，初步證明偶聯(lián)成功。

圖 2-2 OVA、NEO-OVA 紫外掃描光譜Fig. 2-2 The UV scanning spectrum of OVA、NEO-OVASDS-PAGE 凝膠電泳鑒定 2-3 可知，NEO-BSA 的泳動(dòng)速度小于 BSA，而且有較明顯 BSA 的分子量小于 NEO-BSA，初步證明 NEO 與 BSA 偶聯(lián)
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本文編號(hào)：2878965