發(fā)布時間：2018-03-11 03:22

  本文選題：綿羊　切入點：非季節(jié)發(fā)情　出處：《石河子大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：綿羊是典型的季節(jié)性發(fā)情動物,其發(fā)情的季節(jié)性特點一直是制約綿羊生產(chǎn)繁殖效率的瓶頸。目前,針對綿羊季節(jié)性發(fā)情調(diào)控機制的研究主要集中在光通路調(diào)控方面,現(xiàn)普遍認為綿羊的季節(jié)性發(fā)情主要受光通路的調(diào)控,并初步確定了其繁殖活動的光通路季節(jié)性發(fā)情調(diào)控模式圖。但在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),除了日照、溫度等因素影響綿羊的季節(jié)性發(fā)情外,高營養(yǎng)水平飼喂的哈薩克羊在非繁殖(乏情)季節(jié)也可以表現(xiàn)出發(fā)情的現(xiàn)象,研究這一營養(yǎng)水平的改變?nèi)绾握{(diào)控非繁殖季節(jié)綿羊發(fā)情活動,對提高綿羊生產(chǎn)繁殖效率具有重要的指導(dǎo)意義;為此本研究開展了營養(yǎng)誘導(dǎo)舍飼綿羊在非繁殖季節(jié)條件下,發(fā)情相關(guān)micro RNA篩選及其靶基因功能驗證實驗,具體內(nèi)容如下:目的:在不同營養(yǎng)水平處理綿羊中,通過篩選差異表達的micro RNA,用生物信息學(xué)分析方法推測其靶基因,分析靶基因在光通路或其它通路的作用,建立營養(yǎng)調(diào)控發(fā)情的信號通路。方法:(1)構(gòu)建不同營養(yǎng)水平哈薩克羊群,在乏情期對試驗綿羊發(fā)情情況觀察記錄。(2)乏情季節(jié),前后分別屠宰3只發(fā)情(EN)和乏情母羊(AN),分別采集下丘腦(H)、垂體(P)和卵巢(O),共構(gòu)建6個mi RNA文庫,并進行生物信息學(xué)分析。通過實時熒光定量PCR檢測部分mi RNA相對表達量,驗證建庫的可靠性。對差異表達中出現(xiàn)頻率較高的mi R-200a/b/c進行組織表達譜分析。(3)細胞水平驗證實驗。?通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),驗證mi R-200b對靶基因GNAQ的真實干擾作用。?mi R-200b干擾載體轉(zhuǎn)染下丘腦神經(jīng)細胞,選擇GNAQ下游基因ITPR,PRKCB,GNA1,CREB,MAP3K1,GPR54,KISS1及Gn RH進行實時熒光定量檢測。?mi R-200b干擾載體轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細胞,選擇GNAQ下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA基因進行表達量驗證。結(jié)果:(1)高營養(yǎng)實驗組發(fā)情率明顯高于對照組。(2)?下丘腦(HEN vs HAN)兩文庫相比,有8個已知和140個未知mi RNA表達差異顯著。?垂體(PEN vs PAN)兩文庫相比,有14個已知和104個未知mi RNA表達差異顯著。?卵巢(OEN vs OAN)兩文庫比較發(fā)現(xiàn),有9個已知和104個未知mi RNA表達差異顯著。通過軟件預(yù)測出靶基因并進行GO分析發(fā)現(xiàn),以上文庫涉及細胞過程、發(fā)育過程、生長過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)過程、細胞融合、催化活性、繁殖過程和酶調(diào)節(jié)活性過程等。對其調(diào)控通路進行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)有MAPK信號通路(鐘基因相關(guān)通路),Gn RH信號通路(發(fā)情激素相關(guān)),胰島素信號通路,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝和甘油磷脂代謝通路等。通過部分mi RNA的實時熒光定量PCR結(jié)果驗證了建庫的可靠性。對哈薩克羊mi R-200a/b/c進行組織表達譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mi R-200a/b/c在生殖系統(tǒng)垂體、子宮和輸卵管中表達量較高。(3)?以熒光素酶表達結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染GNAQ-3’UTR-psi-CHECKTM-2和pri-mi R-200b-pc DNA3.1(+)的hela細胞組是只轉(zhuǎn)染psi-CHECKTM-2的hela細胞組熒光素酶值的77.5%;其余兩組與只轉(zhuǎn)染psi CHECKTM-2的hela細胞組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。?下丘腦細胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-200b干擾組和對照組相比,GNAQ基因顯著下調(diào),下游ITPR,PRKCB,GNA1和MAP3K1,發(fā)情關(guān)鍵基因GPR54,KISS1和Gn RH顯著上調(diào)。?卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-200b干擾后,GNAQ基因表達量升高,下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA表達量下降。結(jié)論:(1)通過靶基因及相關(guān)發(fā)情通路分析,總結(jié)出從酪氨酸和葉酸兩種營養(yǎng)物質(zhì)出發(fā),有別于光周期調(diào)控發(fā)情的通路:以PI3K基因為中心,下游通過PI3K-AKT通路作用于MEK1基因,或者通過白細胞跨內(nèi)皮遷移通路作用于MMP14基因,繼而作用于MEK1基因,MEK1基因通過Gn RH通路作用于FSH和LH。MEK1還可以通過FcγR-介導(dǎo)吞噬通路作用于PLA2G4A,再通過卵巢類固醇合成通路作用于ALOX5進而影響雌二醇和瘦素的分泌。PI3K基因上游,Rap1通過白細胞跨內(nèi)皮遷移通路作用于PI3K,多巴胺受體基因通過Rap1信號通路作用于Rap1,多巴胺通過多巴胺突觸通路作用于多巴胺受體,其上游受到酪氨酸的調(diào)控。至此建立一條從酪氨酸出發(fā)的營養(yǎng)調(diào)控發(fā)情的通路,和光調(diào)控發(fā)情的通路有所不同。另外,葉酸可以通過內(nèi)吞作用通路作用于SMAD7,繼而作用于下游的SMAD2/3,SMAD2/3通過作用于SMAD4促進雌二醇產(chǎn)生進而影響發(fā)情。以上通路的探討為完善非季節(jié)性營養(yǎng)調(diào)控綿羊發(fā)情網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。(2)通過細胞水平驗證試驗發(fā)現(xiàn)mi R-200b真實靶向調(diào)控GNAQ基因,并可能通過靶向作用GNAQ基因調(diào)控發(fā)情過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻】

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本文編號：1596360