發(fā)布時(shí)間：2018-03-10 11:38

  本文選題：精子RNA　切入點(diǎn)：高通量測序　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在傳統(tǒng)的觀念中,精子的主要作用是給后代提供父源基因組和之后激活胚胎的受精發(fā)育,卵母細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控胚胎發(fā)育,這種片面的理解就導(dǎo)致長時(shí)期以來人們把目光過多的放在卵母細(xì)胞上,而忽略了對精子的認(rèn)識。在受精過程中,蛋白質(zhì)、小的非編碼RNA、mRNA等都會被帶入卵母細(xì)胞中,進(jìn)而對雌雄原核形成、卵裂球分裂時(shí)空的順序、合子基因轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育乃至后代表型等都具有重要的意義,也就意味著精子參與了早期胚胎發(fā)育和介導(dǎo)核進(jìn)行重編程等一系列過程。因此對受精過程中被帶入卵母細(xì)胞的成分進(jìn)行細(xì)致的研究有助于解開發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵性難題。本研究的主要目的是構(gòu)建精子,卵母細(xì)胞和體細(xì)胞的小RNA高通量表達(dá)文庫,篩選出精子差異性表達(dá)的miRNA(microRNA)�；�于此,探索出一套高效提取高質(zhì)量精子RNA的方法是研究其內(nèi)容物和構(gòu)建小RNA表達(dá)文庫的基礎(chǔ)。精子是高密度的濃縮體,攜帶RNA量極少,因此從精子內(nèi)容物中提取RNA難度頗大。此外,由于睪丸中成熟精子量少、鮮精成本高和凍精活力低,我們往往需要額外精細(xì)的提取步驟和RNA質(zhì)控從而保證提取的RNA的濃度和完整性,并且通過RT-PCR檢測提取出的RNA質(zhì)量。采用Solexa高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行篩選牛精源性高表達(dá)的miRNA并且將其外源模擬物注入卵母細(xì)胞,或以誘導(dǎo)表達(dá)的方式賦予體細(xì)胞精子水平,探索精源性miRNA對早期胚胎發(fā)育水平的影響。(1)創(chuàng)新合理的從牛附睪尾部采精并進(jìn)一步獲能純化,之后通過不同方法與實(shí)驗(yàn)條件摸索出提取牛精子RNA最優(yōu)化的方法,通過qRT-PCR對提取的精子RNA進(jìn)行了特征性基因及完整性檢測。實(shí)驗(yàn)從附睪中分離精子并通過上游獲能收集純化成熟的精子,并用加熱到60℃的TRIzol裂解液提取精子RNA,實(shí)驗(yàn)表明可保證較好的純度和完整度;(2)通過Illumina高通量測序建立成熟精子的小RNA文庫,同時(shí)對相應(yīng)的靶基因和通路進(jìn)行了預(yù)測和分析。在miRBase2.0中將18-26 nt的Unique序列比對到相應(yīng)特異性的前體上,共檢測到951個已知的miRNA和8個新的高表達(dá)候選miRNA。精源性的miRNA數(shù)據(jù)庫對胚胎發(fā)育、表觀遺傳學(xué)功能和分子機(jī)制分析提供了基本但十分重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);(3)從三個樣本高通量測序文庫(牛皮膚成纖維細(xì)胞、MII期卵母細(xì)胞和成熟獲能后精子)中篩選得到了精子特異性表達(dá)的miRNA作為初步候選,通過實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證排除測序?qū)嶒?yàn)結(jié)果的假陽性,進(jìn)一步對所獲得的miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分類注釋和表達(dá)模式分析,GO富集性分析和KEGG通路分析。以精子所攜載的miR-202為研究對象,通過外源顯微注射miRNA模擬物進(jìn)入卵母細(xì)胞的形式,模擬正常受精中精子外源帶入miR-202的表達(dá)水平,通過卵裂率和乙酰化水平檢測,發(fā)現(xiàn)它可以提高胚胎發(fā)育和核的重編程能力。(4)構(gòu)建miR-449b的Tet-On 3G誘導(dǎo)表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)過篩選的克隆陽性細(xì)胞經(jīng)強(qiáng)力霉素(Doxycycline,Dox)誘導(dǎo)后作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植,不經(jīng)過Dox誘導(dǎo)的為對照組。結(jié)果表明賦予供核體細(xì)胞以精子樣的miR-449b水平,顯著提高牛體細(xì)胞核移植,胚胎的體外發(fā)育和核的重編程能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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本文編號：1593185