發(fā)布時間：2018-03-10 11:43

  本文選題：雞白痢沙門菌　切入點：細(xì)胞感染模型　出處：《揚州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum,Salmonella Pullorum)具有高度宿主專一性,引起的雞白痢具有高發(fā)病率和高死亡率的特點,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。沙門菌具有獨特的感染細(xì)胞機制,從而保證其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存。不同于志賀菌、李斯特菌逃避細(xì)胞內(nèi)生物膜并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的機制,沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)形成一種稱為沙門菌囊泡(Salmonella-containing vacuole,SCV)的結(jié)構(gòu),沙門菌可在SCV中生存與增殖。目前,關(guān)于沙門菌SCV的研究主要以鼠傷寒沙門菌為模型,雞白痢沙門菌SCV的相關(guān)研究較為匱乏。本研究主要對雞白痢沙門菌感染細(xì)胞后形成SCV的規(guī)律進行研究。通過篩選研究雞白痢沙門菌SCV的合適細(xì)胞模型與菌株,探索雞白痢沙門菌在胞內(nèi)形成SCV的規(guī)律,幫助更好地理解雞白痢沙門菌與宿主細(xì)胞間的互作關(guān)系。同時,本研究建立了鑒定雞白痢沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白功能的研究方法,為深入地研究雞白痢沙門菌的致病機理提供了方案。1.雞白痢沙門菌感染細(xì)胞模型的建立用雞白痢沙門菌S06004分別感染HD-11、DF-1、DT-40和LMH四種禽類細(xì)胞系,測定其黏附率和侵襲率,結(jié)果表明,S06004對HD-11的黏附率與侵襲率最高,LMH次之,DF-1最低。S06004對DT-40的黏附率雖很高,但侵襲率比較低。因此,選擇HD-11和LMH作為雞白痢沙門菌感染的細(xì)胞模型更為適合。對1960s-2010s期間分離的50株雞白痢沙門菌感染HD-11和LMH細(xì)胞的黏附率進行測定。結(jié)果表明,在HD-11細(xì)胞上,大部分菌株的黏附率與S06004相當(dāng),但7101、B8605、S9804和S9876的黏附率偏高,其中S9876的黏附率約是S06004的6倍;在LMH細(xì)胞上,大部分菌株的黏附率與S06004相當(dāng),但S08026、S9876和1306的黏附率偏高,并且S9876的黏附率約是S06004的4倍。在50株雞白痢沙門菌中,S9876是唯一一株在LMH和HD-11上的黏附率均很高的菌株,因此,可作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的候選菌株。為了探索細(xì)菌對黏附率之間的關(guān)系,我們從50株雞白痢沙門菌中挑選出黏附率差異明顯的10株代表菌株,利用雞胚模型進一步比較細(xì)菌的致病力。以103CFU/100μL的劑量尿囊腔接種16日齡的海蘭白雞胚。結(jié)果表明,尿囊腔接種C79-13、6803和6201菌株的雞胚死亡數(shù)量最多,而S9876對雞胚的毒力明顯低于這三株。結(jié)合這三株細(xì)菌在HD-11和LMH上的黏附率,C79-13也可作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的候選菌株。我們進一步比較了C79-13與S9876對HD-11和LMH細(xì)胞的侵襲率,結(jié)果表明C79-13在兩個細(xì)胞系上的侵襲率均高于S9876,因此,我們選擇C79-13作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的模式菌株。2.雞白痢沙門菌SCV的形成規(guī)律探索我們成功構(gòu)建了表達GFP的雞白痢沙門菌C79-13(pYA3334-GFP),選擇EEA1作為早期SCV的標(biāo)記蛋白,Rab7與Lamp1作為中期SCV的標(biāo)記蛋白,以及Cathepsin D作為晚期SCV的標(biāo)記蛋白,用激光共聚焦顯微鏡觀察雞白痢沙門菌C79-13在雞肝癌上皮細(xì)胞系LMH細(xì)胞和禽巨噬細(xì)胞系HD-11細(xì)胞中各階段SCV的形成時間。結(jié)果顯示,在LMH細(xì)胞上,在5 min時約80%的細(xì)菌開始招募EEA1蛋白,形成早期SCV;在15 min時,細(xì)菌開始招募Rab7和Lamp1蛋白,形成中期SCV,且30 min時細(xì)菌招募Rab7的比例最高,而15 min時細(xì)菌招募Lamp1的比例最高;30-45 min時,部分細(xì)菌會招募成熟SCV的標(biāo)記蛋白Cathepsin D,但在60 min時,蛋白招募現(xiàn)象尤為明顯。在禽巨噬細(xì)胞系HD-11上,5-30 min時,可以觀察到早期蛋白EEA1緊緊包圍著細(xì)菌,且比例逐漸升高;15-45 min時,可以觀察到中期蛋白Rab7將細(xì)菌包裹,且比例逐漸升高;中期蛋白Lamp1與晚期蛋白Cathepsin D沒有將細(xì)菌包裹的現(xiàn)象,僅在30-60 min時,有些細(xì)菌招募Cathepsin D蛋白且比例逐漸下降。為證實激光共聚焦顯微鏡觀察到的HD-11細(xì)胞中的結(jié)果,采用透射電鏡直接觀察細(xì)胞中SCV的形成。30 min時,細(xì)胞中可以很明顯地看到不完整、不封閉的SCV;1h時,細(xì)菌分開,SCV的膜結(jié)構(gòu)完整封閉,每個SCV只包含一個細(xì)菌;5 h時,一些SCV開始出現(xiàn)破損,并可觀察到細(xì)菌的增殖及SCV的分裂。3.雞白痢沙門菌T3SS2效應(yīng)蛋白CigR對SCV的影響CigR是一個膜蛋白,由SPI3編碼的T3SS2效應(yīng)蛋白。有研究表明,cigR基因的缺失會引起沙門菌毒力的增強,但也有研究表明,cigR的缺失會導(dǎo)致其在鼠骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力顯著降低。為解析CigR對雞白痢沙門菌SCV的影響,本研究采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌C79-13的cigR基因缺失株C79-13△ciR,并初步解析了 CigR的功能。結(jié)果顯示,cigR的缺失能夠增強雞白痢沙門菌在禽巨噬細(xì)胞HD11中的復(fù)制能力,并使細(xì)菌在胞內(nèi)招募SCV標(biāo)記蛋白Rab7的能力增強。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31
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本文編號：1593196