【摘要】 抗生素是人類在醫(yī)藥領(lǐng)域取得的最偉大成就之一,對人類健康水平的提高和生命安全的保障起到了極其重要的作用。然而,目前國內(nèi)外抗生素濫用的問題十分突出,導(dǎo)致耐藥菌急劇增多,藥害事件不斷發(fā)生,對處于生長發(fā)育時期的兒童影響尤為突出。四平市婦嬰醫(yī)院是四平市唯一兒童�？漆t(yī)院,其抗生素應(yīng)用情況具有代表性,并且呼吸系統(tǒng)感染是兒童常見病和多發(fā)病,也是抗生素應(yīng)用頻率高、種類多的疾病,因此我們對四平市婦嬰醫(yī)院2002-2005年呼吸系統(tǒng)感染住院兒童抗生素應(yīng)用狀況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析,以明確該地區(qū)抗生素使用不合理的原因和環(huán)節(jié);同時對四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染患兒葡萄球菌的檢出率及耐藥性進(jìn)行研究,運用EXCEL軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,分析未應(yīng)用抗生素及應(yīng)用抗生素兩組葡萄球菌的檢出率及耐藥性是否存在差異,繪制兩組葡萄球菌的耐藥趨勢圖,為兒科細(xì)菌耐藥性研究提供依據(jù),為臨床合理使用抗生素提供參考;并用分子生物學(xué)方法分析葡萄球菌耐藥的遺傳機(jī)制,為四平地區(qū)呼吸系統(tǒng)感染兒童所攜帶的葡萄球菌的分子流行病學(xué)研究提供資料。本論文的主要內(nèi)容包括:1.2002-2005年四平市婦嬰醫(yī)院兒科呼吸道感染抗生素應(yīng)用狀況調(diào)查及分析2.抗生素應(yīng)用對葡萄球菌耐藥性的影響3.Sul1及aph(3’)-III基因的檢測 

第一篇 2002－2005年四平市婦嬰醫(yī)院兒科呼吸道感染抗生素應(yīng)用狀況調(diào)查及分析 

在我國，小兒呼吸道感染是兒科常見病和多發(fā)病，且抗生素的使用率極高，為明確四平地區(qū)兒科呼吸道感染疾病抗生素的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題,對2002年1月至2005年12月四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用情況作回顧性調(diào)查分析。 

一、資料與方法 

1．資料 分別隨機(jī)抽取2002、2003、2004、2005年呼吸科住院兒童病例各300份。 

2．方法 統(tǒng)計抗生素應(yīng)用種類、應(yīng)用頻率、用藥總量、實際用藥天數(shù)、約定日劑量（DDD）、藥物利用指數(shù)（DUI）、平均住院天數(shù)、抗生素的聯(lián)合應(yīng)用情況、細(xì)菌檢測及藥敏試驗結(jié)果。約定日劑量（define daily dose，DDD）是WHO藥物利用研究組推薦的測定藥物利用的單位，DDD值由《兒科臨床藥物手冊》常用日劑量確定，DDDs（總DDD數(shù)）=用藥總量/該藥的DDD值，DUI是Ghodse教授提出的藥物利用指數(shù)（drug utilization index，DUI），DUI≤1即為合理，DUI=DDDs/實際用藥天數(shù)。根據(jù)上述數(shù)據(jù)分析抗生素應(yīng)用的狀況、趨勢及合理性。 

二、結(jié)果 

1．2002－2005年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用率均為100％。 

2．2002－2005 年抗生素應(yīng)用種類、應(yīng)用頻率、用藥總量、實際用藥天數(shù)、約定日劑量（DDD）、藥物利用指數(shù)（DUI）分別見表1、2、3、4。 

3．2002－2005 年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用頻率的分布：見圖 1、2、3、4。 

4．2002－2005年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用狀況的對比分析（見表和圖5）：近四年，該地區(qū)青霉素類抗生素的應(yīng)用率低，并呈逐年下降趨勢；青霉素/酶抑制劑類抗生素在 2003 年開始應(yīng)用，應(yīng)用率逐年降低；四年間，頭孢一代抗生素的應(yīng)用率均最低；頭孢三代抗生素的應(yīng)用頻率均穩(wěn)居首位，且遠(yuǎn)高于其他常用抗生素，頭孢二代抗生素的應(yīng)用率均處于第二位，且應(yīng)用率較穩(wěn)定；隨著 2004 年頭孢三代/酶抑制劑投入該地區(qū)兒科臨床，頭孢三代抗生素的使用率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。 

5．平均住院天數(shù)及抗生素的聯(lián)合應(yīng)用狀況：2002年四平地區(qū)呼吸科住院兒童平均住院天數(shù)7.09d，最少2d，最多15d，單用一種抗生素219例，占 73％，住院期間聯(lián)合或先后應(yīng)用兩種抗生素54例，占 18％，三種抗生素 24 例，占 8％，四種抗生素 3 例，占 1％；2003年平均住院天數(shù)5.2d，最少2d，最多15d，單用一種抗生素219例，占73％，住院期間聯(lián)合或先后應(yīng)用兩種抗生素72例，占24％，三種抗生素9例，占3％；2004年平均住院天數(shù)4.11d，最少 2d，最多 13d，單用一種抗生素 237 例，占 79％，兩種抗生素51 例，占 17％，三種抗生素 12 例，占 4％；2005 年平均住院天數(shù)6.2d，最少2d，最多16d，單用一種抗生素195例，占65％，兩種抗生素 75 例，占 25％，三種抗生素 21 例，占 7％，四種抗生素3例，占1％，五種抗生素6例，占2％。

6．細(xì)菌檢測及藥敏試驗結(jié)果：調(diào)查2002－2005年的1200份呼吸科住院兒童病例均未提檢病原體及藥敏試驗報告單。 

第二篇   抗生素應(yīng)用對葡萄球菌耐藥性的影響  

為深入了解兒科抗生素的應(yīng)用對葡萄球菌耐藥性的影響，對四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染患兒葡萄球菌的檢出率及耐藥性進(jìn)行調(diào)查研究，運用 EXCEL 軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，分析未應(yīng)用抗生素及應(yīng)用抗生素兩組葡萄球菌的檢出率及耐藥性是否存在差異，繪制兩組葡萄球菌的耐藥趨勢圖，為兒科細(xì)菌耐藥性研究提供依據(jù)，同時為臨床兒科正確使用抗生素提供第一手資料。 

一、材料及方法 

（一）標(biāo)本的來源     

四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染，但尚未應(yīng)用抗生素的門診患兒的標(biāo)本 250 例，上述時間內(nèi)，呼吸科住院并應(yīng)用抗生素治療達(dá)三天以上的患兒390例。 

（二）標(biāo)本采集、菌株分離、鑒定及藥敏試驗 

1.培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、M-H瓊脂等均購自杭州天和生物制品公司。 

2.生化試劑：甘露醇發(fā)酵管購自杭州天和生物制品公司，兔血漿由本室制備。 

3.主要實驗儀器： SW-CJ-IF凈化工作臺  蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 顯微鏡 Nikon ALPHAPHOT-2 YS2 中國 ES-60J電子分析天平      沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 HG303-5                南京實驗儀器廠 

4.藥敏紙片：青霉素 G、苯唑西林、氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢哌酮、克林霉素、紅霉素、萬古霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、新諾明，購自杭州天和生物制品公司。 

5.質(zhì)控菌：金黃色葡萄球菌ATCC25923 

6.標(biāo)本采集 （1）咽拭子：消毒棉簽適度用力擦拭咽后壁和扁桃體部位，然后迅速放入內(nèi)裝3－5毫升無菌運送液的試管中（運送液為無菌的普通營養(yǎng)肉湯），在靠近頂端處折斷棉簽桿，塞緊瓶塞。 

（2）菌株分離及鑒定 將所取標(biāo)本劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng) 18－24 小時，挑取單個可疑菌落革蘭氏染色，然后接種于甘露醇發(fā)酵管，最后結(jié)合血漿凝固酶試驗將其鑒定至凝固酶陰性及陽性葡萄球菌。 

（3）藥敏試驗：具體方法及結(jié)果判定嚴(yán)格參照美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）1999年制定的《藥片法抗菌藥物敏感試驗操作方法》。方法：用接種環(huán)挑取4－5個菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)4－6小時，然后用生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，使其濁度至0.5號麥?zhǔn)媳葷峁�，充分混勻后用無菌棉簽蘸取上述肉湯培養(yǎng)基，在管壁上擠壓，去除多余的液體，均勻涂于 M-H 瓊脂平板表面，在室溫下干燥 5 分鐘，用無菌鑷子以無菌操作取出含藥紙片貼在涂有細(xì)菌的平板上，輕輕按壓，以保證紙片與培養(yǎng)基牢固接觸，將平皿置37℃恒溫箱培養(yǎng)16－18小時。結(jié)果判定：觀察藥敏紙片周圍有無抑菌環(huán)，量取其直徑（包括紙片直徑）大小，用毫米數(shù)記錄，按抑菌環(huán)直徑的大小報告敏感、中度敏感和耐藥。 

二、結(jié)果與分析 

1.未應(yīng)用抗生素組250例檢出葡萄球菌49株，檢出率19.6％，金黃色葡萄球菌17株（17/49，34.69％），其中MRSA16株（16/49，32.65％）；凝固酶陰性葡萄球菌 32 株（32/49，65.31％），均為MRCNS（32/49，65.31％）。應(yīng)用抗生素組 390 例檢出葡萄球菌 83株，檢出率 21.28％，金黃色葡萄球菌 7 株（7/83，8.43％），均為MRSA（7/83，8.43％）；凝固酶陰性葡萄球菌 76株（76/83，91.57％），其中 MRCNS70 株（70/83，84.34％）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩組菌株葡萄球菌、MRSA與MRCNS的分離率無顯著差異（P＞0.05）。 

2.兩組菌株藥敏試驗結(jié)果見表 6、7； 對 13 種抗生素的耐藥率、中介率、敏感率分布見圖6、7；耐藥分布趨勢見圖8。 3.兩組菌株對 13 種抗生素的耐藥率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理除苯唑西林（P＜0.01）外均無顯著差異（P＞0.05）。 

第三篇Sul1及aph(3')-III基因的檢測┅┅30 

一、材料與方法┅┅┅30 

二、結(jié)果┅┅┅┅ 30 

三、討論┅┅┅┅┅  33 

結(jié)  論 ┅┅┅┅  35 

第三篇  Sul1 及 aph(3')-III 基因的檢測                                                              

一、材料與方法 

1.來源 

上述實驗檢出的耐復(fù)方新諾明葡萄球菌 104 株，耐慶大霉素葡萄球菌44株。 

2.引物 

由上海生物工程公司合成2對引物，參見Sara等人報道設(shè)計的擴(kuò)增Sul1基因的引物，序列為P1：5'－CTTCGATGAGAGCCGCGCGC-3'、P2：5'－GCAAGGCGGAAACCCGCGCC-3',擴(kuò)增的片段為436bp[44]；參見糜祖煌等人報道設(shè)計的擴(kuò)增aph(3')-III基因的引物，序列為P1：5'－GCCGATGTGGATTGCGAAAA-3'、P2：5'－GCTTGATCCCCAGTAAGTCA -3'，擴(kuò)增的片斷292bp[。 

3.主要實驗試劑及儀器 

普通營養(yǎng)瓊脂                 杭州天和生物制品公司 

TaqDNA聚合酶                 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心 

dNTPs                        北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心 

瓊脂糖                        Spain 

2000bpDNA Marker              北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心 

500 bpDNA Marker               北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心 

三用恒溫水浴箱 SHH-W21Y420  北京長安科學(xué)儀器廠 

TGL-16B  低溫離心機(jī)           中國上海安亭科學(xué)儀器廠  

Gne AmpRPCR System 2700        Applied Biosystem USA    

DY-WZ電泳儀                    北京生化儀器廠 

DYY-III型水平電泳槽            北京市六一儀器廠

UV WHITE –2020D 凝膠成像分析系統(tǒng)        美國 

4.相關(guān)試劑的配制    

50×TAE:          242g          Tris堿， 

57.1ml        冰乙酸， 

100ml         0.5mol/LEDTA(PH=8.0)                     

1000ml        蒸餾水   

溴酚蘭指示劑：10ml 溶液中含有:                   

100%甘油               5ml                       

0.5mol/L EDTA(pH=8.0)   2.5ml                       

10% SDS                1ml                       

溴酚蘭                  5mg                       

二甲苯胺                5mg                       

蒸餾水                  1.5ml 

結(jié)    論  

1.四平地區(qū)呼吸科住院兒童100%應(yīng)用抗生素,且抗生素品種單一，主要追求高價位、高檔次的頭孢二代及三代抗生素，選用及換用抗生素不以細(xì)菌檢測及藥敏試驗結(jié)果為依據(jù)，靠經(jīng)驗用藥，少數(shù)病例無明確指征頻繁更換抗生素，一些常用抗生素應(yīng)用過量。 

2.兩組葡萄球菌對青霉素和苯唑西林表現(xiàn)高度耐藥，而對AMP/SBT敏感性較高，因此青霉素和苯唑西林單獨應(yīng)用對葡萄球菌引起的感染失去治療意義，必要時可根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果與其他抗生素聯(lián)用，AMP/SBT抗葡萄球菌作用肯定，可廣泛用于兒科葡萄球菌感染性疾病。 

3.兩組葡萄球菌對第一代頭孢菌素的敏感率均高于第二代及第三代頭孢菌素，因此臨床治療葡萄球菌感染，第一代頭孢菌素優(yōu)于第二代及第三代頭孢菌素。 

4.未應(yīng)用抗生素組及應(yīng)用抗生素組葡萄球菌對對紅霉素耐藥率較高，臨床可將紅霉素與其他敏感且與之有協(xié)同作用的抗生素聯(lián)用。 

5.兩組菌株慶大霉素的敏感率高，臨床可適當(dāng)選用，但要嚴(yán)格按兒科規(guī)定劑量用藥。 

6.兩組葡萄球菌對萬古霉素的敏感率高，抗葡萄球菌療效顯著，但萬古霉素具有耳、腎毒性、靜脈滴注相關(guān)性不良反應(yīng)及血液系統(tǒng)毒性不良反應(yīng)，因此通常不作為兒科一線藥物應(yīng)用, 只有在常用抗菌藥物無效或不能應(yīng)用( 如青霉素過敏) 時使用。 

7.兩組葡萄球菌對13種抗生素的耐藥分布趨勢相似，耐藥性無顯著差異，說明該地區(qū)可能存在細(xì)菌耐藥性迅速播散。 

8.四平地區(qū)葡萄球菌磺胺類藥物耐藥不是由Sul1基因編碼控制的。

9.aph(3')-III基因是四平地區(qū)葡萄球菌耐氨基糖苷類抗生素的主要遺傳因素。
 

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