從Shh通路電針對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)的保護(hù)與神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的影響
發(fā)布時(shí)間：2021-06-03 13:31
前言
缺血性腦卒中屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其主要表現(xiàn)為半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，甚則神昏。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，記載為“薄厥”、“偏風(fēng)”、“偏枯”等，“陽氣者，大怒則形氣絕，血郁于上，使人薄厥”等理論至今指導(dǎo)于中醫(yī)臨床對(duì)于腦卒中的預(yù)防及治療。中風(fēng)其病位于腦，與五臟密切相關(guān)，其病機(jī)主要可由風(fēng)、火、氣、虛、疲、疲引起，這些因素常相互作用而為病。本病本虛標(biāo)實(shí)，其根本為氣血虛衰，肝腎陰虛，其標(biāo)為氣血癖阻，痰濕內(nèi)生，熱而化火，氣血逆亂而上沖腦絡(luò)。其中醫(yī)治療方法除了補(bǔ)陽還五湯等經(jīng)典方藥外，還有沿用了數(shù)千年的針灸療法。目前臨床電針的運(yùn)用較為廣泛，電針能有效地改善腦缺血運(yùn)動(dòng)功能受損，是中醫(yī)促進(jìn)缺血性中風(fēng)患者康復(fù)的主要治療手段。研究表明電針能顯著改善腦卒中患者軟癱期肢體的肌張力，顯著促進(jìn)患者偏癱肢體的運(yùn)動(dòng)功能改善及恢復(fù)?。目前關(guān)于電針治療腦卒中的機(jī)制研究，主要集中在抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自由基損傷、對(duì)抗腦缺血后的炎性反應(yīng)、改善韓超載等[6〕方面。
因此，我們通過制備左側(cè)MCAO再灌注模型，電針腦缺血大鼠患側(cè)肢體“曲池”與“足三里”，觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變,觀測(cè)MCAO大鼠電針后的其腦梗體積變化，檢測(cè)Shh信號(hào)通路相關(guān)因子在蛋白水平及基因水平的表達(dá)、觀測(cè)大鼠腦缺血后及缺血再灌電針后nestin、GFAP形態(tài)學(xué)上的變化，以進(jìn)一步探索電針治療腦缺血的機(jī)制。
……………
1. 實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國(guó)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司所提供的健康雄性Spragure-Dauley大鼠72只，體重為2S0±20g。大鼠于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持恒溫恒濕，并模擬標(biāo)準(zhǔn)12h光照及12h黑夜的標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，予以自由飲食。
1.2主要實(shí)驗(yàn)器械
醫(yī)用口罩、醫(yī)用手套、1ml注射器針筒、鼠板、皮筋、無菌紗布、14cin組織剪、14cm止血鉗、彎鑷、14cm顯微鑷、方尾5. 5動(dòng)脈血管夾、羊腸線、縫合針、縫合線、14cm持針甜、漁線、12. Son顯微剪、30號(hào)華倫牌不繡鋼針（0.5寸）、記號(hào)筆、G6805電針治療儀、1.5ml離心管（Axygen)、PCR八連管及八連管帽（美國(guó)ABI)、各規(guī)格燒杯、玻璃棒、包被多聚賴氨酸載玻片、蓋玻片、轉(zhuǎn)膜濾紙、PVDF膜
1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配置
苦味酸、安爾碘、0.9%氯化鈉溶液、75%酒精、100%酒精、二甲苯、甲醇、10%水合氯酸、液氮、蘇木精溶液、異丙醇、正丁醇、氯仿、DEPC水、4%多聚甲醛、憐酸鹽緩沖液（Hyclone，上海）、電泳粉、TBS、Tween-20、一抗稀釋液（碧云天）、二抗稀釋液（碧云天）、貯檬酸、梓檬酸三鈉、逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒（Ferraentas)、PMSF(碧云天）、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（碧云天）、BCA工作液（碧云天，上海）、5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（碧云天）、脫脂奶粉（碧云天）、DAB試劑盒（福州邁新）、Tris (signmal )、甘氨酸（signmal )、2，3，5-氯化三苯四氮哩（Sigma, USA)、蛋白預(yù)染彩虹Marker (Fermentas)、上樣緩沖液考馬斯亮藍(lán)、shh、nestin 及 glil—抗(Santa Cruz，美國(guó)）、Trizol (Invitrogen, CACCC)、e-atin、CDK4、CyclinDl —抗及辣根過氧化物酶二抗（CST，美國(guó)），Nestin、GFAP (Abeam公司），SYBE Green (Roche,美國(guó)）、shh、glil、CDK4、CyclinDl、GAPDH 引物（上海生工）、RIPA裂解液（碧云天)、濕盒等。
……………
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果...........12
3.1電針大鼠患肢“曲池”及“足三里”穴能顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及大鼠的行.......... 12
4.討論........19
結(jié)論.............22
4.討論
4.1電針與缺血性腦卒中
目前缺血性腦卒中的治療方式有多種方式，目前臨床使用的治療藥物主要為溶栓藥物、降纖藥物、抗血小板聚集藥物、神經(jīng)保護(hù)藥物及抗凝藥物等[22]，但對(duì)肢體功能等神經(jīng)康復(fù)作用局限。而超早期溶栓與急性期神經(jīng)元保護(hù)療法也因治療措施收到諸多限制，而僅有少數(shù)患者受益[23]。電針療法是改善缺血性中風(fēng)神經(jīng)癥狀的常用方法，臨床報(bào)道及實(shí)驗(yàn)均證實(shí)針灸治療腦卒中療效顯著，尤其是對(duì)神經(jīng)功能的康復(fù)，如'肢體運(yùn)動(dòng)、語言、吞咽功能等有促進(jìn)作用[24]。針刺治療腦卒中的途徑，相關(guān)機(jī)制研究主要圍繞在促進(jìn)腦血管側(cè)枝循環(huán)建立并改善腦血流及腦含氧量、改善腦電活動(dòng)、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自由基損傷、對(duì)抗腦缺血后的炎性反應(yīng)、改善及抑制鈣超載等[6]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了電針對(duì)腦缺血的神經(jīng)功能有顯著改善。
4. 2電針治療腦卒中的相關(guān)中醫(yī)學(xué)理論
腦卒中在中醫(yī)屬于“中風(fēng)”病，是以突然昏倒不省人事，伴半身不遂，口角歪斜，為主要臨床特點(diǎn)的疾病。多數(shù)臨床及實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究多以不同的方法，不同的穴位以治療腦卒中，有特定穴、巨刺取穴法等。其中“曲池”和“足三里”為陽明經(jīng)的合穴，“曲池”為大腸經(jīng)合穴，而“足三里”是足陽明胃經(jīng)的合穴及胃經(jīng)的下合穴，兩者均具多氣多血的特點(diǎn)，可補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶正祛邪，針對(duì)中風(fēng)病的本虛標(biāo)實(shí)有治本之功；脾胃為五谷之海，為氣血生化之源，針刺“足三里”“曲池”可通調(diào)腹氣，使氣機(jī)條暢，氣血調(diào)和，進(jìn)而能達(dá)到活血化瘀的功效；再者，此二穴位于肢體的肘膝關(guān)節(jié)附近，根據(jù)經(jīng)絡(luò)的近端治療作用，及遠(yuǎn)端治療作用“經(jīng)絡(luò)所過，主治所及”，因而可以對(duì)中風(fēng)遺留的半身不遂進(jìn)行較為有效地治療。兩個(gè)穴位的臨床及基礎(chǔ)研究均顯示療效顯著[14]�！秲�(nèi)經(jīng)》的“治痿獨(dú)取陽明”，對(duì)腦卒中后肢體功能障礙具有指導(dǎo)性的作用。有研究對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行整理[25」發(fā)現(xiàn)，近年來針刺治療腦卒中的取穴規(guī)律，其選穴以中陽明經(jīng)的穴位出現(xiàn)頻率較高，而陽明經(jīng)穴則以“足三里”“曲池”出現(xiàn)次數(shù)最多，可見“曲池、足三里”為臨床最為常用的治療腦卒中的有效穴。
近年來，人們已經(jīng)從胚胎及成年動(dòng)物的腦組織中分離出具自我分化及更新能力的神經(jīng)千細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)。NSCs具有多向分化潛能、遷徙能力及良好組織融合性、促進(jìn)神經(jīng)元再生和損傷的修復(fù)，為腦卒中的治療提供了新的方法。而有學(xué)者提出[2b’，神經(jīng)干細(xì)胞這一概念有待于規(guī)范化，在神經(jīng)的發(fā)生發(fā)展過程中，最早具分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的可稱之為神經(jīng)祖細(xì)胞，而具分化成這些類型的神經(jīng)單位，才可稱之為神經(jīng)干細(xì)胞，而這一概念很難界定，因而稱之為神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞較為合理，若這類細(xì)胞的可塑性進(jìn)一步降低，則可稱之為神經(jīng)前體細(xì)胞。NSCs對(duì)腦卒中的治療可分為內(nèi)源性NSCs的激活增殖和外源性NSCs移植。而外源性NSCs移植受免疫因素、移植細(xì)胞劑量、移植時(shí)間、移植與康復(fù)時(shí)間窗、致瘤風(fēng)險(xiǎn)影響，其運(yùn)用還有待于進(jìn)一步探討_。
本文編號(hào)：8731
缺血性腦卒中屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其主要表現(xiàn)為半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，甚則神昏。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，記載為“薄厥”、“偏風(fēng)”、“偏枯”等，“陽氣者，大怒則形氣絕，血郁于上，使人薄厥”等理論至今指導(dǎo)于中醫(yī)臨床對(duì)于腦卒中的預(yù)防及治療。中風(fēng)其病位于腦，與五臟密切相關(guān)，其病機(jī)主要可由風(fēng)、火、氣、虛、疲、疲引起，這些因素常相互作用而為病。本病本虛標(biāo)實(shí)，其根本為氣血虛衰，肝腎陰虛，其標(biāo)為氣血癖阻，痰濕內(nèi)生，熱而化火，氣血逆亂而上沖腦絡(luò)。其中醫(yī)治療方法除了補(bǔ)陽還五湯等經(jīng)典方藥外，還有沿用了數(shù)千年的針灸療法。目前臨床電針的運(yùn)用較為廣泛，電針能有效地改善腦缺血運(yùn)動(dòng)功能受損，是中醫(yī)促進(jìn)缺血性中風(fēng)患者康復(fù)的主要治療手段。研究表明電針能顯著改善腦卒中患者軟癱期肢體的肌張力，顯著促進(jìn)患者偏癱肢體的運(yùn)動(dòng)功能改善及恢復(fù)?。目前關(guān)于電針治療腦卒中的機(jī)制研究，主要集中在抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自由基損傷、對(duì)抗腦缺血后的炎性反應(yīng)、改善韓超載等[6〕方面。
因此，我們通過制備左側(cè)MCAO再灌注模型，電針腦缺血大鼠患側(cè)肢體“曲池”與“足三里”，觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變,觀測(cè)MCAO大鼠電針后的其腦梗體積變化，檢測(cè)Shh信號(hào)通路相關(guān)因子在蛋白水平及基因水平的表達(dá)、觀測(cè)大鼠腦缺血后及缺血再灌電針后nestin、GFAP形態(tài)學(xué)上的變化，以進(jìn)一步探索電針治療腦缺血的機(jī)制。
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【學(xué)位級(jí)別】：碩士
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國(guó)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司所提供的健康雄性Spragure-Dauley大鼠72只，體重為2S0±20g。大鼠于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持恒溫恒濕，并模擬標(biāo)準(zhǔn)12h光照及12h黑夜的標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，予以自由飲食。
1.2主要實(shí)驗(yàn)器械
醫(yī)用口罩、醫(yī)用手套、1ml注射器針筒、鼠板、皮筋、無菌紗布、14cin組織剪、14cm止血鉗、彎鑷、14cm顯微鑷、方尾5. 5動(dòng)脈血管夾、羊腸線、縫合針、縫合線、14cm持針甜、漁線、12. Son顯微剪、30號(hào)華倫牌不繡鋼針（0.5寸）、記號(hào)筆、G6805電針治療儀、1.5ml離心管（Axygen)、PCR八連管及八連管帽（美國(guó)ABI)、各規(guī)格燒杯、玻璃棒、包被多聚賴氨酸載玻片、蓋玻片、轉(zhuǎn)膜濾紙、PVDF膜
1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配置
苦味酸、安爾碘、0.9%氯化鈉溶液、75%酒精、100%酒精、二甲苯、甲醇、10%水合氯酸、液氮、蘇木精溶液、異丙醇、正丁醇、氯仿、DEPC水、4%多聚甲醛、憐酸鹽緩沖液（Hyclone，上海）、電泳粉、TBS、Tween-20、一抗稀釋液（碧云天）、二抗稀釋液（碧云天）、貯檬酸、梓檬酸三鈉、逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒（Ferraentas)、PMSF(碧云天）、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（碧云天）、BCA工作液（碧云天，上海）、5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（碧云天）、脫脂奶粉（碧云天）、DAB試劑盒（福州邁新）、Tris (signmal )、甘氨酸（signmal )、2，3，5-氯化三苯四氮哩（Sigma, USA)、蛋白預(yù)染彩虹Marker (Fermentas)、上樣緩沖液考馬斯亮藍(lán)、shh、nestin 及 glil—抗(Santa Cruz，美國(guó)）、Trizol (Invitrogen, CACCC)、e-atin、CDK4、CyclinDl —抗及辣根過氧化物酶二抗（CST，美國(guó)），Nestin、GFAP (Abeam公司），SYBE Green (Roche,美國(guó)）、shh、glil、CDK4、CyclinDl、GAPDH 引物（上海生工）、RIPA裂解液（碧云天)、濕盒等。
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3實(shí)驗(yàn)結(jié)果...........12
3.1電針大鼠患肢“曲池”及“足三里”穴能顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及大鼠的行.......... 12
4.討論........19
結(jié)論.............22
4.討論
4.1電針與缺血性腦卒中
目前缺血性腦卒中的治療方式有多種方式，目前臨床使用的治療藥物主要為溶栓藥物、降纖藥物、抗血小板聚集藥物、神經(jīng)保護(hù)藥物及抗凝藥物等[22]，但對(duì)肢體功能等神經(jīng)康復(fù)作用局限。而超早期溶栓與急性期神經(jīng)元保護(hù)療法也因治療措施收到諸多限制，而僅有少數(shù)患者受益[23]。電針療法是改善缺血性中風(fēng)神經(jīng)癥狀的常用方法，臨床報(bào)道及實(shí)驗(yàn)均證實(shí)針灸治療腦卒中療效顯著，尤其是對(duì)神經(jīng)功能的康復(fù)，如'肢體運(yùn)動(dòng)、語言、吞咽功能等有促進(jìn)作用[24]。針刺治療腦卒中的途徑，相關(guān)機(jī)制研究主要圍繞在促進(jìn)腦血管側(cè)枝循環(huán)建立并改善腦血流及腦含氧量、改善腦電活動(dòng)、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自由基損傷、對(duì)抗腦缺血后的炎性反應(yīng)、改善及抑制鈣超載等[6]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了電針對(duì)腦缺血的神經(jīng)功能有顯著改善。
4. 2電針治療腦卒中的相關(guān)中醫(yī)學(xué)理論
腦卒中在中醫(yī)屬于“中風(fēng)”病，是以突然昏倒不省人事，伴半身不遂，口角歪斜，為主要臨床特點(diǎn)的疾病。多數(shù)臨床及實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究多以不同的方法，不同的穴位以治療腦卒中，有特定穴、巨刺取穴法等。其中“曲池”和“足三里”為陽明經(jīng)的合穴，“曲池”為大腸經(jīng)合穴，而“足三里”是足陽明胃經(jīng)的合穴及胃經(jīng)的下合穴，兩者均具多氣多血的特點(diǎn)，可補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶正祛邪，針對(duì)中風(fēng)病的本虛標(biāo)實(shí)有治本之功；脾胃為五谷之海，為氣血生化之源，針刺“足三里”“曲池”可通調(diào)腹氣，使氣機(jī)條暢，氣血調(diào)和，進(jìn)而能達(dá)到活血化瘀的功效；再者，此二穴位于肢體的肘膝關(guān)節(jié)附近，根據(jù)經(jīng)絡(luò)的近端治療作用，及遠(yuǎn)端治療作用“經(jīng)絡(luò)所過，主治所及”，因而可以對(duì)中風(fēng)遺留的半身不遂進(jìn)行較為有效地治療。兩個(gè)穴位的臨床及基礎(chǔ)研究均顯示療效顯著[14]�！秲�(nèi)經(jīng)》的“治痿獨(dú)取陽明”，對(duì)腦卒中后肢體功能障礙具有指導(dǎo)性的作用。有研究對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行整理[25」發(fā)現(xiàn)，近年來針刺治療腦卒中的取穴規(guī)律，其選穴以中陽明經(jīng)的穴位出現(xiàn)頻率較高，而陽明經(jīng)穴則以“足三里”“曲池”出現(xiàn)次數(shù)最多，可見“曲池、足三里”為臨床最為常用的治療腦卒中的有效穴。
近年來，人們已經(jīng)從胚胎及成年動(dòng)物的腦組織中分離出具自我分化及更新能力的神經(jīng)千細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)。NSCs具有多向分化潛能、遷徙能力及良好組織融合性、促進(jìn)神經(jīng)元再生和損傷的修復(fù)，為腦卒中的治療提供了新的方法。而有學(xué)者提出[2b’，神經(jīng)干細(xì)胞這一概念有待于規(guī)范化，在神經(jīng)的發(fā)生發(fā)展過程中，最早具分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的可稱之為神經(jīng)祖細(xì)胞，而具分化成這些類型的神經(jīng)單位，才可稱之為神經(jīng)干細(xì)胞，而這一概念很難界定，因而稱之為神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞較為合理，若這類細(xì)胞的可塑性進(jìn)一步降低，則可稱之為神經(jīng)前體細(xì)胞。NSCs對(duì)腦卒中的治療可分為內(nèi)源性NSCs的激活增殖和外源性NSCs移植。而外源性NSCs移植受免疫因素、移植細(xì)胞劑量、移植時(shí)間、移植與康復(fù)時(shí)間窗、致瘤風(fēng)險(xiǎn)影響，其運(yùn)用還有待于進(jìn)一步探討_。
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實(shí)驗(yàn)結(jié)論
通路的激活可能參與了電針“曲池”及“足三里”穴對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用，改善大鼠的功能障礙缺損，減少腦梗面積，促進(jìn)巢蛋白及GFAP的表達(dá)。
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參考文獻(xiàn)（略）
本文編號(hào)：8731
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