CaMKⅡδ及bcl-2、bax在新西蘭大白兔心肌肥厚模型中的作用研究
【摘要】 目的：探討新西蘭大白兔心肌肥厚時CaMK Ⅱδ和凋亡基因bcl-2、bax在其心肌組織中的表達規(guī)律及相互關系,明確CaMK Ⅱδ及凋亡基因bcl-2、bax在肥厚心肌中的作用,進一步明確心肌細胞凋亡的調控機制,為臨床研發(fā)防止心肌肥厚、減少心肌細胞凋亡及心力衰竭發(fā)生的新藥提供新思路和方向。方法：1、40只新西蘭大白兔按隨機原則分為實驗組及對照組,每組各20只,雌雄不限,實驗組新西蘭大白兔采用腹主動脈縮窄術進行心肌肥厚造模,對照組新西蘭大白兔僅行開腹手術,不縮窄腹主動脈即關閉腹腔。術后8周分別對實驗組和對照組進行超聲心動圖檢查,確定實驗組造模成功后,分別處死實驗組及對照組新西蘭大白兔,并留取心臟標本進行檢測。2、采用熒光定量PCR檢測實驗組及對照組新西蘭大白兔心肌組織中CaMKHⅡδ、bcl-2及bax的表達量。3、統(tǒng)計學分析,比較實驗組和對照組心肌組織中CaMK Ⅱδ和bcl-2、bax表達量的變化關系,以及CaMK Ⅱδ和bcl-2/bax表達情況的相關性分析。結果：1、實驗組新西蘭大白兔術后8周均出現(xiàn)室間隔(IVS)和左室后壁(LVPW)的明顯增厚(P<0.05),為明顯心肌肥厚的表現(xiàn),而射血分數(shù)(EF)及舒張末(LVDd)、收縮末(LVDs)未見明顯差異(P>0.05),表明術后8周實驗組新西蘭大白兔均出現(xiàn)明顯的心肌肥厚表現(xiàn),而對照組相應指標未見明顯改變；2、與對照組相比,實驗組新西蘭大白兔心肌組織中CaMKⅡδ的表達明顯增加(P<0.01)：3、與對照組相比,實驗組新西蘭大白兔心肌組織中bcl-2表達減少而bax表達增加,差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05),bcl-2/bax比值明顯減小(P<0.05)；4、實驗組新西蘭大白兔心肌組織中CaMK Ⅱδ表達量增加與bcl-2/bax比值減小呈明顯相關性,而對照組未見有明顯的相關性。結論：1、通過腹主動脈縮窄術建立心肌肥厚模型的方法是可性并有效的,超聲心動圖檢查可較好地反映心肌肥厚的程度,主要表現(xiàn)在LVPW及IVS增厚,說明實驗組新西蘭大白兔在腹主動脈縮窄術后8周均出現(xiàn)左室肥厚,對照組無明顯變化,表明8周的造模時間已經(jīng)足夠讓其明顯出現(xiàn)左室肥厚；實驗組及對照組EF均未見有明顯變化,表明心力哀竭的發(fā)展需要更長的時間；2、CaMK Ⅱδ信號轉導通路是心肌肥厚形成重要環(huán)節(jié)之一,同時心肌肥厚時伴有明顯的心肌細胞凋亡,二者呈明顯相關性,表明CaMK Ⅱδ表達增加可能通過降低bcl-2/bax而誘導心肌細胞凋亡,共同導致心肌肥厚。
引言
一直以來，心腦血管疾病是發(fā)達國度的重要去世亡緣故原由，比年來我國的抱病率明顯上升，嚴峻影響中老年人的康健。病理性心肌肥厚(Pathological myocardial hypertrophy)是心臟對壓力、容量超負荷等應激的一種順應性反響，是浩繁心血管疾病的配合病理歷程，常見于高血壓、冠心病、心肌梗去世、心瓣膜病、天本性心臟病等多種心血管疾病。病理性心肌肥厚是心血管疾病的獨立傷害因子，它可以明顯增長室性心律變態(tài)、心力弱竭乃至心源性猝去世等心血管不測變亂的產(chǎn)生11]，因此研究心肌肥厚的產(chǎn)生生長，賜與以早期干涉處置處罰、逆轉肥厚，具有重要的意義。
現(xiàn)在臨床患者固然顛末恒久服用降壓藥等血壓得到較好的控制，但心肌肥厚的產(chǎn)生仍得不到有用緩解，現(xiàn)在治療心肌肥厚的藥物重要有：1、血管告急素轉換酶克制劑（ACEIs)，如依那普利等；2、血管告急素II受體阻斷劑(ARBs)，如氯沙坦等；f丐離子拮抗劑，有報道表現(xiàn)《丐離子拮抗劑是反抗心肌肥厚最好的藥物，明顯優(yōu)于ACEIs,常用的銷苯地同等；3、別的的如利尿劑等，一樣通常不但獨利用，多與別的抗心肌肥厚藥物團結用藥。臨床抗心肌肥厚治療已經(jīng)被證明不但能進步左室貫注及冠狀動脈儲備，還能淘汰心律變態(tài)、猝去世等的產(chǎn)生，進步心血管疾病的預后結果。但現(xiàn)在臨床抗心肌肥厚藥物其機制研究仍未非常明白。
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第一部分文獻硏究
一、心肌肥厚的分子機制硏究進展
心肌肥厚（Myocardial hypertrophy)是心臟對各種刺激所產(chǎn)生的適應性增生，其表現(xiàn)為心肌細胞體積的增大，非心肌細胞（如成纖維細胞、膠原等）的生成與增殖，同時伴有心室結構和功能的改變。心肌肥厚時，心肌細胞的蛋白合成增加、體積增大、直徑增長，心肌肌節(jié)數(shù)量增多，纖維組織增生，而心肌細胞的數(shù)量卻沒有增加，常伴有胚胎基因再表達。其主要的病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質增生以及心肌細胞外基質重建等。心肌肥厚的發(fā)病機制與壓力負荷增加、神經(jīng)內分泌因素、鈣離子超載、原癌基因等密切相關'5—7]。
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二、 Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶n (CaMKII)與'心肌肥厚的研究進展
細胞內Ca2+在多種不同的細胞功能中均起著重要的作用。許多研究表明[16-181：細胞內Ca2+信號的改變是心肌肥厚反應的首要刺激，在心肌肥厚和基因表達中發(fā)揮主要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可經(jīng)多條信號途徑誘導心肌肥厚的形成：
(1)Ca2+通過結合調蛋白(CaM)激活Ca2+-CaM依賴性的蛋白激酶(CaMK)，誘導心肌增強因子(MEF2)表達增多參與心肌肥厚；
(2)Ca2+激活鈣調憐酸酶(calcineurin, CaN),激活的《丐調憐酸酶可以刺激胞衆(zhòng)活化T細胞核因子去憐酸化，使之進入核內與GATA4轉錄因子結合，促進心肌肥厚的發(fā)生；
(3)Ca2+-二酰基甘油-蛋白激酶C-絲裂素活化蛋白激酶通路；
(4)Ca2+-肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)途徑；
(5)Ca2+直接入核與鈣結合蛋白結合等多種信號通道介導心肌肥厚。
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第二部分 實驗研究 .........................19-27
一、動物模型 ........................19-20
(一) 材料 .........................19
(二) 模型制備 .......................19-20
(三) 超聲心動圖檢查 ...............20
二、實驗方法 .........................20-24
(一) 引物設計 .................21
(二) 組織細胞總RNA制備(異硫氰酸胍GCT法) ............21-22
(三) 逆轉錄反應 ..............22-23
(四) 熒光定量(SYBR Green Ⅰ Assay) .............23-24
(五) 統(tǒng)計分析 .............24
三、研究結果 ..............24-27
(一) 動物模型變化................ 24-25
(二) 心臟重量變化 .................25
(三) 熒光定量PCR結果變化.............. 25-27
第三部分 分析與討論
近年來研究表明'53^{病因素通過肥大信號刺激引起細胞反應改變的信號傳導途徑是心肌肥厚發(fā)病的關鍵。心肌肥厚時存在Ca2+信號紊亂和基因表達異常，細胞內Ca2+濃度升高是心肌肥厚信號轉導發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而心臟作為泵的主要功能很大程度上取決于心肌細胞，研究表明心肌肥厚時伴有明顯的心肌細胞凋亡的發(fā)生，但其發(fā)生機制仍未十分明確。
本研究通過腹主動脈縮窄術建立新西蘭大白兔心肌肥厚的動物模型，研究Ca2+依賴的蛋白激酶和凋亡基因的表達規(guī)律及關系，探討Ca2+信號與細胞凋亡在心肌肥厚發(fā)生過程中的病理生理意義，以進一步闡明心肌肥厚形成的機制。
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結語
隨著生活方式的改變，心血管疾病目^是世界h發(fā)病率和致死率很A-的疾病之--，最新研究已證明心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因子，它"UA^ifl加心源性猝死、慢性心力衰竭和室性心律失常等心血管意外事件的發(fā)生率和死0卞，故研究心肌肥厚發(fā)生發(fā)展，予以早期干預、逆轉肥厚，具有重要的意義。
本研究通過腹主動脈縮窄術建立新西蘭大白兔心肌肥厚模型，探i、t肥的心肌組織中CaMK ]15和凋亡基因bcl-2、 bax /H心肌組織的表達規(guī)忭，明確CaMK II 5對心肌細胞凋亡的調控機制，為臨床研發(fā)減少心肌細胞凋1::,防止心肌肥I1/發(fā)生的新藥提供新思路。
研究證明CaMKll的過度表達4心肌細胞凋1:：均參4了心肌肥^的發(fā)屮機制，M新研究也表明CaMKll通過對相關凋亡^W進行調節(jié)，從而引起心肌細胞凋廣，參與心肌肥厚的發(fā)生，心肌細胞是代償性心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭的--個Tt^H-折點，這將為臨床丌發(fā)具有特異性抑制細胞凋1'：的新藥研究及使用時間提供依抝；和方向。如我們可以設計多種途徑來抑制CaMKll的藥物，如抑制CaMKII催化區(qū)ATP結合、維持CaMK II抑制性構象、阻止CaMK II與靶蛋A相結合、阻止CaM結合到caMK ]1和附止CaMK 11非Ca2+依賴性活化的藥物(如氧化應激)。隨若對CaMK 11 {,j ''}H' 3途徑的深入研究，CaMK II可望成為未來心肌肥厚和心袞治療的新靶點。
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本文編號：9209
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