關(guān)于NP-5基因在不同組織下mRNA的表達(dá)與新西蘭兔消化道紊亂討論
發(fā)布時間：2014-09-12 21:31
【摘要】 隨著規(guī)�；B(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展,家兔消化道紊亂特別是非特異性消化道紊亂(non-specific digestive disorders)制約著整個兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,腹瀉是家兔非特異性消化道紊亂的主要臨床癥狀。防御素作為一種陽離子抗菌肽在先天性免疫和獲得性免疫中起著非常重要的作用,本試驗(yàn)以新西蘭兔為材料,采用Case-Control試驗(yàn)設(shè)計(jì),通過直接測序的方法尋找DEFB1、DEFB135、NP-5基因不同區(qū)域的突變位點(diǎn),針對突變位點(diǎn)采用PCR-RFLP、HRM技術(shù)進(jìn)行基因分型,分析以上基因遺傳變異與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性間的關(guān)聯(lián)性；根據(jù)防御素遺傳變異與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性分析結(jié)果及突變位點(diǎn)的重要性篩選出DEFB135、NP-5基因,檢測其腸道m(xù)RNA表達(dá)量。采用低纖維誘導(dǎo)新西蘭兔發(fā)病,根據(jù)炎癥的不同程度將低纖維群體分為健康組、輕微組和嚴(yán)重組,分析新西蘭兔不同炎癥程度下DEFB135、NP-5基因在回腸、結(jié)腸、圓小囊組織中mRNA表達(dá)量,分析不同基因型對NP-5基因表達(dá)量的影響。試圖尋找與新西蘭兔非特異性消化道紊亂性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記,為新西蘭兔的分子標(biāo)記輔助選擇和抗病育種提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下：1通過直接測序法尋找DEFB1基因外顯子2、DEFB135基因、NP-5基因編碼區(qū)多態(tài),結(jié)果表明：在DEFB1基因外顯子2上游20bp處存在T>G;DEFB135基因5’-UTR存在2個SNPs(c.-47T>A,c.-40C>A),3’-UTR存在1個SNP(c.*42C>G),且3個SNPs位點(diǎn)完全連鎖；NP-5基因mRNA序列存在1個SNP r.154C>A,為非同義突變,導(dǎo)致p.Ala26Asp。2基于Case-Control試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用HRM技術(shù)對DEFB1、NP-5基因突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,結(jié)果表明：DEFB1基因外顯子2上游20bp處T>G位點(diǎn),T等位基因在Case-Control組的頻率分別為66%和69%,說明T等位基因在兩群體中處于優(yōu)勢地位,TT基因型(39%vs45%)、TG基因型(53%vs49%)、GG基因型(8%vs6%)在Case-Control組群體間差異不顯著(P>0.05)。G等位基因的OR值為1.29(95%置信區(qū)間為：0.88-1.89,P=0.21),表明DEFB1外顯子2上游20bp處T>G位點(diǎn)與新西蘭兔非特異性消化道紊亂無顯著關(guān)聯(lián)。NP-5基因r.154C>A位點(diǎn),A等位基因在Case-Control組的頻率分別為：22%和33%,A等位基因在兩群體間頻率差異達(dá)到顯著水平(P<0.05),A等位基因的OR值為0.577(95%置信區(qū)間為0.39-0.085,P=0.0046),AA基因型的OR為0.16(95%置信區(qū)間為0.06-0.43,P<0.0001),表明A等位基因和AA基因型能降低新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性風(fēng)險(xiǎn)。采用PCR-RFLP技術(shù)對DEFB135基因c.-40C>A位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,結(jié)果表明：A等位基因在Case組和Control組比例相當(dāng),A等位基因的OR值為1.11(95%的置信區(qū)間為0.85-1.46,P=0.44),表明DEFB135c.-40C>A位點(diǎn)與新西蘭兔非特異性消化道紊亂無顯著關(guān)聯(lián)。3三組織中,DEFB135基因表達(dá)量在結(jié)腸高于回腸和圓小囊,其中在圓小囊中的表達(dá)量最少；在回腸和結(jié)腸組織中隨著炎癥的加重DEFB135基因mRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢,在圓小囊中,輕微組的表達(dá)量顯著低于嚴(yán)重組(P<0.05)。三組織中,NP-5基因在圓小囊中的表達(dá)量最高,結(jié)腸中的表達(dá)量最低；在結(jié)腸和圓小囊組織中,從不同炎癥程度對表達(dá)量的影響來看,隨著炎癥的加重表達(dá)水平呈上升趨勢,而在回腸組織中,嚴(yán)重組表達(dá)量低于輕微組而高于健康組,且三組織中不同炎癥狀態(tài)間表達(dá)量差異不顯著(P>0.05);在回腸組織中AA型表達(dá)量極顯著高于CC型(P<0.01)且顯著高于CA型(P<0.05),在圓小囊組織中AA型表達(dá)量顯著高于CC型(P<0.05);三組織中,能降低新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性風(fēng)險(xiǎn)的AA基因型表達(dá)量最高,CA型次之,CC型的表達(dá)量最低。由此說明DEFB1基因外顯子2上游20bp T>G位點(diǎn)、DEFB135基因(c.-47T>A, c.-40C>A, c.*42C>G)位點(diǎn)與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感無顯著關(guān)聯(lián),而NP-5基因r.154C>A位點(diǎn)與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感關(guān)聯(lián),這為進(jìn)一步研究NP-5基因在新西蘭兔非特異性消化道紊亂機(jī)制的作用提供理論依據(jù),為抗病育種奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 新西蘭兔； α、β-防御素； SNP； 非特異性消化道紊亂；
1文獻(xiàn)綜述
1.1家兔非特異性消化道紊亂研究進(jìn)展
我國是養(yǎng)兔大國，兔產(chǎn)業(yè)主要分布在四川、山東、福建、重慶、河北、河南、山西等地，家兔飼養(yǎng)量和兔產(chǎn)品產(chǎn)量均居世界首位，兔毛及兔肉出口量也居世界首位。兔肉被譽(yù)為“益智肉，保健肉，美容肉”，是因?yàn)槠渚哂懈叩鞍�、高氨基酸、高消化率和低膽固醇、低脂肪、低熱量，賴氨酸、憐脂、媽、維生素的含量也很高，特別適宜老人、小孩食用。隨著人們生活水平的提高，飲食愛好也有所偏向，兔肉越來越受到人們的青睞。因此規(guī)�；图s化養(yǎng)兔也得到快速發(fā)展，但是家兔疾病尤其是家兔消化道紊亂制約著整個兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)有關(guān)資料顯示，死亡家兔中因家兔消化道紊亂的比例占70%11]。
............................
1.2引起家兔非特異性消化道紊亂的原因
1.2.1病原微生物襲擊
引起家兔消化道素亂的病原微生物很多，主要有細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。大腸桿菌，多殺性巴氏桿菌，沙門氏菌，魏氏梭菌等是主要的致病細(xì)菌，其中以大腸桿菌為首。曾有人在比利時和荷蘭養(yǎng)兔場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，21個兔場中存在粘附腸上皮并破壞微絨毛的大腸桿菌占70%17]。大腸桿菌在幼畜出生后，從口進(jìn)入腸道，在腸道內(nèi)大量繁殖。生產(chǎn)中大腸桿菌通常與其他病原菌混合感染發(fā)病，例如大腸桿菌與巴氏桿菌混合感染、與鏈球菌的混合感染19]、與球蟲病的混合感染與沙門氏菌混合感染、與魏氏梭菌、沙門氏菌，球蟲病的混合感染。
............................
2試驗(yàn)材料和方法
2.1試驗(yàn)材料
2.1.1試驗(yàn)動物的選擇及樣本的采集
(1) Case-Control群體的建立及樣本的采集
Case-Control試驗(yàn)所用新西蘭兔由四川成都市愛華畜牧科技有限公司種兔場提供，其營養(yǎng)水平和管理水平參考Zhangl56]等試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)期從28日齡斷奶至84日齡，試驗(yàn)期間飼料營養(yǎng)水平和管理水平一致，且新西蘭兔未服任何藥品，每天仔細(xì)觀察新西蘭兔所有表現(xiàn)并詳細(xì)記錄。
將試驗(yàn)期間觀察發(fā)現(xiàn)有拉稀，身體消瘦，腹部臌脹，排膠凍狀或黑色水樣排泄物，死后剖檢發(fā)現(xiàn)十二指腸、空腸脹氣或有積液，盲腸脹氣，回腸、結(jié)腸內(nèi)有膠凍物質(zhì)，除此之外未發(fā)現(xiàn)其他疾病的新西蘭兔歸為Case組。而試驗(yàn)期間飲食正常且健康活撥無任何疾病的新西蘭兔歸為Control組。
....................
2.2試驗(yàn)方法
2.2.1試驗(yàn)樣品的提取
2.2.1.1全基因組DNA提取
采取的耳組織樣采用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒（AxyPrep? MuitisourceGenomic DNA Miniprep Kit)提取，按照動物組織中提取基因組DNA的步驟提取。試驗(yàn)前準(zhǔn)備：先對所用器具、試劑、耗材進(jìn)行消毒滅菌。按照試劑盒要求在去鹽液中加入56 ml的無水乙醇并混合均勻；將蛋白酶K粉末溶解在蛋白酶K緩沖液中混合均勻（不能用漩禍振蕩）；開啟水浴鍋，調(diào)至56°C，將eluent或去離子水放入水浴鍋中加熱，備用。
..........................
3 結(jié)果與分析 .....................28-43
3.1 基因組DNA提取結(jié)果 ...................28-29
3.2 總RNA提取結(jié)果 ......................29
3.3 DEFB1、DEFB135、NP-5基因Case-Control關(guān)聯(lián)分析 .............29-36
3.3.1 DEFB1、DEFB135、NP-5基因PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果 ............29-31
3.3.2 DEFB1、DEFB135、NP-5基因分型結(jié)果 ............31-36
3.4 功能預(yù)測.............. 36-37
3.4.1 DEFB135基因5'-UTR功能預(yù)測 ...............36-37
3.4.2 NP-5基因蛋白功能預(yù)測 ...........37
3.5 腸道表達(dá)基因的篩選 ...........37
3.6 DEFB135、NP-5基因在不同組織中mRNA的表達(dá) ..............37-43
3.6.1 DEFB135、NP-5基因熒光定量表達(dá)結(jié)果 ...........37-39
3.6.2 DEFB135基因在回腸、結(jié)腸、圓小囊組織中mRNA的表達(dá)............ 39-43
討論
4.1 DEFBU DEFBI35、TV尸-5基因遺傳變異分析
4.1.1DEFBI、DEFBI35、NP-5 基因 SNP 分析
本試驗(yàn)尋找新西蘭兔DEFBI、DEFB135、NP-5基因SNP位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEFBI基因外顯子2上游20 bp處存在1個SNP T>G; ￡>￡^別3?5基因存在3個SNPs位點(diǎn)(C.-47T>A, C.-40 OA, C.M2 OG),其中 c,47T>A, c,40 OA 在 Z)五基因 5’-UTR區(qū)，而c.*42C>G在3’-UTR區(qū)，通過直接測序的方法發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點(diǎn)完全連鎖，這有可能是家兔單一起源而導(dǎo)致DEFBI35遺傳多樣性比較低的主要原因。NP-5基因編碼區(qū)存在1個SNP (r.l54 OA)。
..................................
結(jié)論
5.1 Z)￡/①7基因外顯子2上游20 bp處存在1個SNPT〉G，Z)￡F573_5基因5’-UTR存在 2 個 SNPs (C.-47 T>A, c,40 OA)和 3’-UTR 存在 1 個 SNP (c.*42 C〉G)，三個SNPs位點(diǎn)完全連鎖，NP-5基因mRNA存在1個SNPr.154 OA，為非同義突變。
5.2 DEFBI、D五基因SNP與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感無顯著關(guān)聯(lián)，7VP-5基因r.]54 OA位點(diǎn)A等位基因?qū)π挛魈m兔非特異性消化道素亂具有保護(hù)作用，AA型能降低新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性風(fēng)險(xiǎn)。
5.3DEFB135基因mRNA表達(dá)量與新西蘭兔NSDD相關(guān)。
5.4 NP-5基因mRNA表達(dá)量與新西蘭兔NSDD可能相關(guān)，基因r. 154OA位點(diǎn)多態(tài)性與NP-5基因mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)。
..........................
參考文獻(xiàn):
本文編號：8862
【關(guān)鍵詞】 新西蘭兔； α、β-防御素； SNP； 非特異性消化道紊亂；
1文獻(xiàn)綜述
1.1家兔非特異性消化道紊亂研究進(jìn)展
我國是養(yǎng)兔大國，兔產(chǎn)業(yè)主要分布在四川、山東、福建、重慶、河北、河南、山西等地，家兔飼養(yǎng)量和兔產(chǎn)品產(chǎn)量均居世界首位，兔毛及兔肉出口量也居世界首位。兔肉被譽(yù)為“益智肉，保健肉，美容肉”，是因?yàn)槠渚哂懈叩鞍�、高氨基酸、高消化率和低膽固醇、低脂肪、低熱量，賴氨酸、憐脂、媽、維生素的含量也很高，特別適宜老人、小孩食用。隨著人們生活水平的提高，飲食愛好也有所偏向，兔肉越來越受到人們的青睞。因此規(guī)�；图s化養(yǎng)兔也得到快速發(fā)展，但是家兔疾病尤其是家兔消化道紊亂制約著整個兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)有關(guān)資料顯示，死亡家兔中因家兔消化道紊亂的比例占70%11]。
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1.2引起家兔非特異性消化道紊亂的原因
1.2.1病原微生物襲擊
引起家兔消化道素亂的病原微生物很多，主要有細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。大腸桿菌，多殺性巴氏桿菌，沙門氏菌，魏氏梭菌等是主要的致病細(xì)菌，其中以大腸桿菌為首。曾有人在比利時和荷蘭養(yǎng)兔場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，21個兔場中存在粘附腸上皮并破壞微絨毛的大腸桿菌占70%17]。大腸桿菌在幼畜出生后，從口進(jìn)入腸道，在腸道內(nèi)大量繁殖。生產(chǎn)中大腸桿菌通常與其他病原菌混合感染發(fā)病，例如大腸桿菌與巴氏桿菌混合感染、與鏈球菌的混合感染19]、與球蟲病的混合感染與沙門氏菌混合感染、與魏氏梭菌、沙門氏菌，球蟲病的混合感染。
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2試驗(yàn)材料和方法
2.1試驗(yàn)材料
2.1.1試驗(yàn)動物的選擇及樣本的采集
(1) Case-Control群體的建立及樣本的采集
Case-Control試驗(yàn)所用新西蘭兔由四川成都市愛華畜牧科技有限公司種兔場提供，其營養(yǎng)水平和管理水平參考Zhangl56]等試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)期從28日齡斷奶至84日齡，試驗(yàn)期間飼料營養(yǎng)水平和管理水平一致，且新西蘭兔未服任何藥品，每天仔細(xì)觀察新西蘭兔所有表現(xiàn)并詳細(xì)記錄。
將試驗(yàn)期間觀察發(fā)現(xiàn)有拉稀，身體消瘦，腹部臌脹，排膠凍狀或黑色水樣排泄物，死后剖檢發(fā)現(xiàn)十二指腸、空腸脹氣或有積液，盲腸脹氣，回腸、結(jié)腸內(nèi)有膠凍物質(zhì)，除此之外未發(fā)現(xiàn)其他疾病的新西蘭兔歸為Case組。而試驗(yàn)期間飲食正常且健康活撥無任何疾病的新西蘭兔歸為Control組。
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2.2試驗(yàn)方法
2.2.1試驗(yàn)樣品的提取
2.2.1.1全基因組DNA提取
采取的耳組織樣采用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒（AxyPrep? MuitisourceGenomic DNA Miniprep Kit)提取，按照動物組織中提取基因組DNA的步驟提取。試驗(yàn)前準(zhǔn)備：先對所用器具、試劑、耗材進(jìn)行消毒滅菌。按照試劑盒要求在去鹽液中加入56 ml的無水乙醇并混合均勻；將蛋白酶K粉末溶解在蛋白酶K緩沖液中混合均勻（不能用漩禍振蕩）；開啟水浴鍋，調(diào)至56°C，將eluent或去離子水放入水浴鍋中加熱，備用。
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3 結(jié)果與分析 .....................28-43
3.1 基因組DNA提取結(jié)果 ...................28-29
3.2 總RNA提取結(jié)果 ......................29
3.3 DEFB1、DEFB135、NP-5基因Case-Control關(guān)聯(lián)分析 .............29-36
3.3.1 DEFB1、DEFB135、NP-5基因PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果 ............29-31
3.3.2 DEFB1、DEFB135、NP-5基因分型結(jié)果 ............31-36
3.4 功能預(yù)測.............. 36-37
3.4.1 DEFB135基因5'-UTR功能預(yù)測 ...............36-37
3.4.2 NP-5基因蛋白功能預(yù)測 ...........37
3.5 腸道表達(dá)基因的篩選 ...........37
3.6 DEFB135、NP-5基因在不同組織中mRNA的表達(dá) ..............37-43
3.6.1 DEFB135、NP-5基因熒光定量表達(dá)結(jié)果 ...........37-39
3.6.2 DEFB135基因在回腸、結(jié)腸、圓小囊組織中mRNA的表達(dá)............ 39-43
討論
4.1 DEFBU DEFBI35、TV尸-5基因遺傳變異分析
4.1.1DEFBI、DEFBI35、NP-5 基因 SNP 分析
本試驗(yàn)尋找新西蘭兔DEFBI、DEFB135、NP-5基因SNP位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEFBI基因外顯子2上游20 bp處存在1個SNP T>G; ￡>￡^別3?5基因存在3個SNPs位點(diǎn)(C.-47T>A, C.-40 OA, C.M2 OG),其中 c,47T>A, c,40 OA 在 Z)五基因 5’-UTR區(qū)，而c.*42C>G在3’-UTR區(qū)，通過直接測序的方法發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點(diǎn)完全連鎖，這有可能是家兔單一起源而導(dǎo)致DEFBI35遺傳多樣性比較低的主要原因。NP-5基因編碼區(qū)存在1個SNP (r.l54 OA)。
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結(jié)論
5.1 Z)￡/①7基因外顯子2上游20 bp處存在1個SNPT〉G，Z)￡F573_5基因5’-UTR存在 2 個 SNPs (C.-47 T>A, c,40 OA)和 3’-UTR 存在 1 個 SNP (c.*42 C〉G)，三個SNPs位點(diǎn)完全連鎖，NP-5基因mRNA存在1個SNPr.154 OA，為非同義突變。
5.2 DEFBI、D五基因SNP與新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感無顯著關(guān)聯(lián)，7VP-5基因r.]54 OA位點(diǎn)A等位基因?qū)π挛魈m兔非特異性消化道素亂具有保護(hù)作用，AA型能降低新西蘭兔非特異性消化道紊亂易感性風(fēng)險(xiǎn)。
5.3DEFB135基因mRNA表達(dá)量與新西蘭兔NSDD相關(guān)。
5.4 NP-5基因mRNA表達(dá)量與新西蘭兔NSDD可能相關(guān)，基因r. 154OA位點(diǎn)多態(tài)性與NP-5基因mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)。
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參考文獻(xiàn):
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本文編號：8862
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