胞嘧啶核苷,也稱為胞苷,是核苷類保健食品與藥物重要的原料,市場需求量很大。胞苷主要通過微生物發(fā)酵方法獲得,但現(xiàn)有菌株的胞苷發(fā)酵水平不高,受到多種因素影響。優(yōu)化菌株細(xì)胞內(nèi)胞苷的合成代謝方式及提高胞苷分泌效率是提高發(fā)酵單位的主要途徑。胞苷可能是通過多種轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的,尿嘧啶通透酶(pyrP,EC3.1.3.104,由pyrP基因編碼,分子量48KDa)和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NupC,EC2.3.1.256,由NupC基因編碼,分子量43 KDa)可能與胞苷分泌過程有關(guān)。本研究通過構(gòu)建尿嘧啶通透酶和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NupC過表達(dá)體系,分析這兩個基因的過表達(dá)對菌體細(xì)胞生長與胞苷發(fā)酵的影響,研究尿嘧啶通透酶和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胞苷分泌過程的作用,從而不斷提高菌體發(fā)酵胞苷的產(chǎn)率。具體研究內(nèi)容如下:1、異源pyP基因過表達(dá)載體構(gòu)建及其對胞苷發(fā)酵的影響。從解淀粉芽孢桿菌BG-09基因組DNA上PCR擴(kuò)增pyrP基因,并與pSTV28載體進(jìn)行連接構(gòu)建質(zhì)粒載體pSTV28-pyrP。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入Escherichia coliBG-08中,得到重組菌E.coliBG-08P。使用0.5 mmol/L ...

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２胞苷在大腸桿菌中的生物合成途徑［７］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｃｙｔｉｄｉｎｅ?ｉｎ?Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ??

尿嘧啶通透酶（；７＞ｒＰ，?ＥＣ?３．１．３．１０４，由砂ｒＰ基因編碼，分子量４８ＫＤａ），解淀粉芽孢??桿菌中尿嘧啶通透酶基因位于嘧啶操縱子的前端，尿嘧啶通透酶和嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密??切，添加其表達(dá)劑量將在胞嘧啶的合成中起重要作用。操縱子含有１０個基因，如圖１－３所??不，ｐｙｒ....

圖２－１４胞苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１４?ＨＰＬＣ?ｏｆＣｙｔｉｄｉｎｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ??

２．２．９?ｐＳＴＶ２８質(zhì)粒的提取??挑取單克隆提取質(zhì)粒，使用ＴＩＡＮＧＥＮ質(zhì)粒小提試劑盒（ＤＰ１０３）試劑盒法提�。穑樱裕郑玻�??質(zhì)粒，提取步驟如圖２－１２。使用前先在漂洗液ＰＷ中加入無水乙醇，將５００?ｍＬ平衡液ＢＬ??加入吸附柱ＣＰ３中（吸附柱放入收集管中），以１２０００?....

圖2-15胞普高效液相色譜圈

Ｆｉｇｕｒｅ?２－１５?ＨＰＬＣ?ｏｆ?Ｃｙｔｉｄｉｎｅ??ａ：對照菌；ｂ：重組菌??實(shí)驗(yàn)結(jié)果??大腸桿菌五．ｃｏ＂?ＢＧ－０８生長曲線??０．９?－??０．８?？??０．７?？?３＾．?＾?＾??０．６??〇?０．５?／??§〇．?■?／??０３?－?廣??０．２?／??０１?....

圖２－１６￡．ａ？＂ＢＧ－０８生長曲線??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１６?Ｇｒｏｗｔｈ?Ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｅ．ｃｏｌｉ?ＢＧ－０８??－．－

?１０．０??ａｉｃ??圖２－１５胞苷高效液相色譜圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１５?ＨＰＬＣ?ｏｆ?Ｃｙｔｉｄｉｎｅ??ａ：對照菌；ｂ：重組菌??２．３實(shí)驗(yàn)結(jié)果??２．３．１大腸桿菌五．ｃｏ＂?ＢＧ－０８生長曲線??０．９?－??０．８?？??０．７?？?３＾．?＾?＾??０．６??....

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