發(fā)布時(shí)間：2021-04-02 20:22

  目的：本實(shí)驗(yàn)主要研究Ovo12基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,以下簡稱EMT)過程及其侵襲力、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響,并進(jìn)一步探討其中可能存在的分子機(jī)制,以期為肺腺癌的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。方法：第一部分實(shí)驗(yàn)我們以臨床手術(shù)切除標(biāo)本為基礎(chǔ),通過免疫組化(Immunohistochemistry)實(shí)驗(yàn),我們檢測不同分期、不同分化程度及癌旁組織中Ovo12蛋白的表達(dá)水平,明確Ovo12的表達(dá)水平是否會(huì)有差異。第二部分細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均通過培養(yǎng)肺腺癌細(xì)于體外完成。培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株A549,通過構(gòu)建并感染PLV-BSD-Ovol2(過表達(dá)Ovo12)及PLV-BSD-Control慢病毒形成實(shí)驗(yàn)組(過表達(dá)Ovol2)和對照組；首先,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(Quant it ative Real-time PCR,以下簡稱Real-time PCR)檢測實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞中與EMT相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平變化,明確Ovo12過表達(dá)后是否能夠在mRNA水平抑制抑制與EMT相關(guān)基因的表達(dá)；進(jìn)一步,我們采用Western-Blot蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記蛋白,如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、 N-鈣黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白表達(dá)水平,從而進(jìn)一步明確是否被Ovol2所抑制；更進(jìn)一步,我們通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin immunoprecipitation,以下簡稱ChIP)、熒光素酶實(shí)驗(yàn)(Luciferase Reporter Gene Assays,以下簡稱LUC實(shí)驗(yàn))及拯救實(shí)驗(yàn)(rescue實(shí)驗(yàn))來進(jìn)一步探究其可能的分子機(jī)制。最后,我們通過劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound Healing)及侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)比較實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化,從直觀上直接觀察細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果：Ovol2基因過表達(dá)后,不論在mRNA還是在蛋白表達(dá)水平,E-鈣黏蛋白表達(dá)上升,N-鈣黏蛋白及波形蛋白表達(dá)下降；如若進(jìn)一步同時(shí)將被Ovo12基因明顯抑制的轉(zhuǎn)錄因子Twistl過表達(dá)后,這種抑制作用會(huì)被部分抵消。而且,Ovo12可以直接結(jié)合與轉(zhuǎn)錄因子Twist1的啟動(dòng)子序列,從而來調(diào)控(抑制)其表達(dá),這種抑制作用是一種劑量依賴性的；最后肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力也相應(yīng)的被抑制。結(jié)論：Ovo12基因可以通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子Twistl的表達(dá)來抑制肺腺癌細(xì)胞的EMT過程,從而抑制其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲力。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1560635