目的： 假性維生素D缺乏性佝僂病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets, PDDR),是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,系編碼25OHD31α羥化酶的CYP27B1基因突變所致,目前基因突變已發(fā)現(xiàn)近四十種,本組前期的研究首次在5名中國(guó)PDDR患者中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新突變,但這幾個(gè)突變對(duì)25OHD3Iα羥化酶的功能影響尚未證實(shí)。因此本實(shí)驗(yàn)的主要目的是在構(gòu)建CYP27B1體外過(guò)表達(dá)體系的基礎(chǔ)上,研究我組新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)錯(cuò)義突變G57V和L333F對(duì)25OHD3Iα羥化酶活性的影響,進(jìn)而加深臨床醫(yī)生對(duì)于突變型和臨床表型關(guān)系的認(rèn)識(shí)。 方法： 1.通過(guò)定點(diǎn)誘變將突變引入連接在質(zhì)粒載體pCMVXL5上的CYP27BlcDNA,構(gòu)建突變型CYP27B1基因G57V和L333F,并在體外大量擴(kuò)增,得到大量的載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒DNA。 2.通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒至293T人胚腎細(xì)胞,構(gòu)建CYP27B1野生型和突變型基因的體外過(guò)表達(dá)體系 3.轉(zhuǎn)染36小時(shí)后,向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的底物250HD3,然后放入C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),使野生型和突變型酶在適當(dāng)條件下進(jìn)行體外羥化反應(yīng)； 4.收集細(xì)胞培養(yǎng)液,經(jīng)過(guò)提取和C18柱純化,用放免法對(duì)不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行250HD3和1,25(OH)2D3濃度的檢測(cè),通過(guò)SPSS析因分析,比較突變型與野生型不同基因型之間是否存在顯著差異 5.收集完細(xì)胞培養(yǎng)液后將細(xì)胞提取總蛋白,通過(guò)western blot檢測(cè)驗(yàn)證野生型和突變型的蛋白在體外是否有表達(dá)及表達(dá)水平是否一致。 結(jié)果： 1. CYP27B1野生型和突變型基因在293T細(xì)胞體外過(guò)表達(dá)體系中均有所表達(dá),而且表達(dá)水平一致。 2.體外過(guò)表達(dá)的野生型和突變型CYP27B1均具酶活性,可以產(chǎn)生1,25(OH)2D3并被檢測(cè)到,突變型CYP27B1組1,25(OH)2D3水平顯著減低,其中G57V和L333F的酶活性分別為野生型的56.8%和70.75%。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了1α羥化酶(CYP27B1)在293T人胚腎細(xì)胞中的體外過(guò)表達(dá)模型,并以此為基礎(chǔ),對(duì)于在中國(guó)人群中首次發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致PDDR的兩個(gè)錯(cuò)義突變進(jìn)行了功能研究。結(jié)果顯示：突變型G57V和L333F的酶活性較野生型顯著減低,且與患者的臨床表型具有一定聯(lián)系。

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R591.44
【目錄】：

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 崔寧宜;1、北京地區(qū)絕經(jīng)后女性腹主動(dòng)脈鈣化與骨質(zhì)疏松的關(guān)系2、25羥維生素D-1α羥化酶（CYP27B1）突變基因的功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張媛;1，25-二羥維生素D_3對(duì)COPD患者肺功能和生活質(zhì)量的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

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【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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3 吳秉毅，許紹輝，孔憲濤;SIRPH在肝纖維化中的意義[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1996年01期

4 張菊娥,陳宗德,付潤(rùn)芳,張翠英,張國(guó)太;肺癌患者血淋巴細(xì)胞芳香烴羥化酶誘導(dǎo)性及血清脂質(zhì)過(guò)氧化水平測(cè)定[J];河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1997年04期

5 張進(jìn)祿,徐群淵,田竟生,楊慧,鄭少鵬,劉玉軍;轉(zhuǎn)基因細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J];解剖學(xué)報(bào);1997年02期

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