發(fā)布時間：2020-11-21 22:57

　　 植物在生長發(fā)育過程中會受到很多非生物脅迫的威脅,例如高pH、氧化、干旱、熱、鹽等脅迫,都嚴重影響著植物的生長發(fā)育。Ca~(2+)是植物中普遍存在的第二信使,廣泛參與植物的生長狀態(tài)、衰老速度的調(diào)控,在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫等方面也起著重要的作用。鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)是一組鈣離子感受器,能夠與一類蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)互作來解碼特異Ca~(2+)信號,從而對逆境脅迫作出響應(yīng)。CBL家族在許多物種中都有研究,但目前對大豆CBL家族的研究較少。本文以“黑農(nóng)52”為實驗材料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分析了高pH、高鎂、氧化脅迫條件下大豆GmCBL2基因的表達模式,并分析了該基因的生物信息學(xué)特征;通過同源克隆技術(shù),從大豆中克隆了與擬南芥AtCBL2基因同源的GmCBL2基因,并構(gòu)建了GmCBL2基因的植物過表達載體,將該基因成功轉(zhuǎn)化到煙草中。對轉(zhuǎn)基因植株進行抗逆性分析,確定了該基因與非生物脅迫耐受性的關(guān)系。獲得的主要研究成果如下:1.GmCBL2基因在逆境脅迫下的表達模式分析對大豆幼苗分別進行高pH(100mmol/L NaHCO_3)、高鎂(20mmol/L MgCl_2)、氧化(10mmol/L H_2O_2)脅迫處理,通過qRT-PCR分析GmCBL2基因在0、1、5、12、24h的表達模式,結(jié)果表明,GmCBL2基因?qū)θ�種脅迫均有不同程度的應(yīng)答,但被氧化脅迫誘導(dǎo)最顯著。2.GmCBL2基因的克隆與序列分析根據(jù)擬南芥AtCBL2基因序列在大豆數(shù)據(jù)庫(www.Phytozome.com/soybean)進行同源比對獲得大豆同源序列GmCBL2,通過RT-PCR克隆獲得GmCBL2基因CDS序列,該序列全長681bp,編碼226個氨基酸。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析表明,GmCBL2蛋白與木豆中的同源蛋白的親緣關(guān)系最近。3.GmCBL2基因?qū)�煙草的遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建了pBWA(V)HS-GmCBL2植物過表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,獲得了轉(zhuǎn)GmCBL2基因的PCR陽性植株。RT-PCR結(jié)果證明GmCBL2已在轉(zhuǎn)錄水平表達。4.轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性鑒定對轉(zhuǎn)基因植株進行了100mmol/L NaHCO_3、10mmol/L H_2O_2、20mmol/L MgCl_2脅迫下的表型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株離體葉片在高pH、高鎂脅迫下葉片均黃化,但在氧化脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉片仍然保持鮮綠,而野生型葉片黃化明顯。對轉(zhuǎn)基因植株進行了10mmol/L H_2O_2脅迫下的氧化脅迫相關(guān)生理指標(biāo)(POD、CAT、SOD、MDA)分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株清除活性氧自由基的能力總體高于野生型植株,表明GmCBL2能夠通過提高抗氧化酶活性來增強植株對氧化脅迫的抗性。
【學(xué)位單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

哈爾濱師范大學(xué)碩士學(xué)位論文個 CBL 成員都有自己的位置特點和功能屬性。例如，CBL1，CBL4，CBL5L9 具有雙重脂質(zhì)修飾位點的 N 端（MGCXXS）[14]；CBL4 的脂質(zhì)修飾位點賴氨酸殘基（KKKKK），推測該區(qū)域有助于與磷脂之間的相互作用[15]。CBL19 主要定位在細胞質(zhì)膜上[16]，但 CBL4和 CBL5 則在全細胞中均存在定位[17]。 的 N 末端由 21 個疏水性氨基酸殘基替代脂質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域，使自身能夠從液靶向到細胞質(zhì)膜[18]。Lin 等人也證明 CBL10 被磷酸化后可以與細胞質(zhì)膜結(jié)究還表明，負責(zé)細胞質(zhì)膜靶向的 N 末端疏水殘基約為 25 個氨基酸組成[19]。CBL3 和 CBL6 具有延伸的 N 端，它負責(zé) CBL 蛋白的液泡膜定位[17]。此外，是由 N 端的三個半胱氨酸殘基的脂質(zhì)修飾作用而成[20]。CBL3 和 CBL6 定位膜上[14]，而 CBL7 和 CBL8 存在于細胞質(zhì)和細胞核中[19]。相關(guān)數(shù)據(jù)還顯示族能夠感知由脅迫應(yīng)激引起的胞質(zhì)鈣信號，并作為壓力信號傳導(dǎo)。

6圖 1-2 植物應(yīng)答逆境的 CBL-CIPK 信號途徑[34, 49]Fig.1-2 CBL-CIPK signal pathway of plants response to stresses. 展望述，CBL-CIPK 網(wǎng)絡(luò)信號系統(tǒng)可以響應(yīng)植物對逆境的應(yīng)答IPK 復(fù)合體傳遞逆境 Ca2+信號的過程。盡管在該領(lǐng)域很多研但是仍有很多 CBLs 未知功能有待研究。目前已經(jīng)從擬南芥抗逆基因，也從一些模式植物中了解到一些相關(guān)生化機理一復(fù)雜通路，仍需要關(guān)于 CBL-CIPK 功能機理的更多研究作物耐逆新品種的育種實踐。

圖 2-3 三種脅迫下 GmCBL2 基因的表達模式Fig.2-3 The expression patterns of GmCBL2 gene under different stresses2.4 討論植物在生長發(fā)育過程中會受到各種環(huán)境因子的影響，不良的環(huán)境因子會抑制甚至損害植物的正常生長發(fā)育�；�因在不同時間段、不同脅迫條件下的表達特征可以反映出基因在抵御逆境過程中的功能特點。目前已有越來越多的研究表明CBL 家族對植物的不同脅迫有響應(yīng)。擬南芥基因組含有 10 個 CBL 基因，大多基因都參與脅迫信號傳導(dǎo)途徑[3]。已有研究表明 AtCBL2 基因參與高 pH 和鎂脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]，因此本試驗也進行了高 pH 和高鎂處理，來檢測 GmCBL2 是否也具有這樣的功能。擬南芥 AtCBL2和 AtCBL3 在高鎂環(huán)境下，可以與下游靶細胞結(jié)合，從而防止植物受其侵害[35]，進一步研究發(fā)現(xiàn)，AtCIPK3/9/23/26 與 AtCBL2/3 是在液泡膜上進行互作，可以將細胞內(nèi)多余的 Mg2+流入液泡，而且 Atcipk3/9/23/26 突變體同樣對 Mg2+有高度的敏感性[34-35]
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本文編號：2893728