發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 12:41

　　 目的:初級(jí)纖毛是一種進(jìn)化上高度保守,存在于哺乳動(dòng)物大部分細(xì)胞表面的,呈毛發(fā)狀的細(xì)胞器。其作為細(xì)胞的物理化學(xué)感受器和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心,調(diào)控著細(xì)胞的增殖、極性、遷移和侵潤(rùn)等生理病理過(guò)程。完整的結(jié)構(gòu)及正常的裝配和解聚是初級(jí)纖毛行使其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。纖毛缺失、纖毛相關(guān)基因的突變等均會(huì)引起纖毛功能障礙,導(dǎo)致纖毛病的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn),大量已知化合物對(duì)初級(jí)纖毛的組裝與解聚有潛在影響,并會(huì)進(jìn)一步影響惡性腫瘤、多囊性腎病等纖毛相關(guān)疾病的進(jìn)展。而目前國(guó)內(nèi)外的纖毛體外研究模型,在鑒定大量藥物對(duì)初級(jí)纖毛完整性影響方面,都存在一定局限性。因此,本課題通過(guò)構(gòu)建基于熒光顯微鏡及相關(guān)分析軟件的高通量篩選方法,來(lái)篩選和鑒定在活細(xì)胞中對(duì)于纖毛組裝和拆卸有影響的化合物,以期更經(jīng)濟(jì)高效地從現(xiàn)有藥物中篩選出能影響纖毛結(jié)構(gòu)和功能的藥物、發(fā)現(xiàn)可能對(duì)纖毛病有影響的化合物。方法:在調(diào)研文獻(xiàn)后選擇ARL13B、SMO及MCHR1作為標(biāo)記初級(jí)纖毛的標(biāo)簽蛋白,采用基因工程技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hTERT-RPE1-ARL13B-EGFP、hTERTRPE1-SMO-EGFP、hTERT-RPE1-MCHR1-TdTomato細(xì)胞株。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)簽蛋白與纖毛標(biāo)志蛋白的共定位情況、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中纖毛對(duì)血清刺激響應(yīng)的靈敏度等方式驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中初級(jí)纖毛的結(jié)構(gòu)與基本功能。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后,再根據(jù)血清誘導(dǎo)不同密度細(xì)胞的纖毛的解聚,模擬藥物促進(jìn)纖毛分解的效果,以初步構(gòu)建高通量篩選影響纖毛完整性的藥物的方法。最后通過(guò)測(cè)試幾種已報(bào)道的能顯著影響纖毛分解的藥物對(duì)該方法進(jìn)行檢驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證并優(yōu)化了該篩選方法。結(jié)果:采用分子克隆方式構(gòu)建的三種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中,帶熒光標(biāo)簽的ARL13B、SMO及MCHR1蛋白均定位于hTERT-RPE1細(xì)胞的初級(jí)纖毛上,且基本不影響初級(jí)纖毛的正常組裝、解聚及對(duì)外界刺激的響應(yīng)。構(gòu)建的基于ImageXpress成像系統(tǒng)及相關(guān)軟件的,在活細(xì)胞中進(jìn)行的自動(dòng)化高通量篩選方法,在細(xì)胞密度合適時(shí),能有效分析鑒定出對(duì)纖毛解聚有顯著促進(jìn)或抑制作用的藥物。結(jié)論:本課題構(gòu)建了藥物對(duì)活細(xì)胞中初級(jí)纖毛完整性影響的高通量篩選細(xì)胞模型,及其自動(dòng)化分析方法,經(jīng)驗(yàn)證本方法基本能鑒別顯著影響纖毛拆卸的藥物。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

2圖 1.1 纖毛的結(jié)構(gòu)示意圖。（a）纖毛是由纖毛膜、軸絲和基體組成的毛發(fā)狀細(xì)胞器。根據(jù)的結(jié)構(gòu)不同，纖毛可分為三類：（b）初級(jí)纖毛，軸絲為“9×2 + 0”結(jié)構(gòu)，由 9 對(duì)外周雙微管與連接絲組成。（c）運(yùn)動(dòng)纖毛，由 9 對(duì)雙聯(lián)體微管、內(nèi)/外動(dòng)力蛋白臂、輻條及 1 對(duì)中管組成，為“9×2+2”結(jié)構(gòu)。（d）節(jié)點(diǎn)纖毛，軸絲為“9×2 + 0”結(jié)構(gòu)，由九對(duì)雙重微管接絲和內(nèi)/外動(dòng)力蛋白臂組成。Fig 1.1 Schematic diagrams of cilium structure. (a) Cilia is a hair-like organelle composed ciliary membrane, axoneme, and basal body. (b) Primary cilia: the axoneme is "9x2+0" struconsisting of nine pairs of doublet microtubules and nexin. (c) Motile cilia consist of 9 pairs of dmicrotubules, inner/outer dynein arms, radial spoke and a pair of central singlet microtubules, wh"9x2+2" structure. (d) Node cilia: the axoneme is "9x2+0" structure, consisting of nine pairs of domicrotubules, nexin and inner/outer dynein arms.

江 蘇 大 學(xué) 碩 士纖毛軸絲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是基體（或稱為母γ 微管蛋白）構(gòu)成，為軸絲 α、β 微管蛋白二軸絲外覆的纖毛膜是特化的細(xì)胞質(zhì)膜，完全相同[1, 14]。最近的一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，有六膜、纖毛基體及其相關(guān)附屬結(jié)構(gòu)上，這其中些受體蛋白，就像嵌在纖毛膜上的“探頭”物理、化學(xué)或生物信號(hào)分子刺激，然后將信子效應(yīng)器或 Hedgehog（Hh）[16-19]、Wnt[20-22等信號(hào)通路的相應(yīng)下游信號(hào)蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞分化等生理病理過(guò)程，具體作用模式如

進(jìn)纖毛分解；還可激活 INPP5E55 來(lái)抑制纖毛發(fā)生[37]。而在分子機(jī)制方面，目前纖毛在正�；虿±�?xiàng)l件下分解的具體機(jī)制相對(duì)而言研究較為清晰的是，在體外研究中，由血清引起的細(xì)胞纖毛分機(jī)制如下：在加入血清后，解聚驅(qū)動(dòng)蛋白成員 Kif2a 和 Kif24 被HEF1-Aurora A 途徑迅速誘導(dǎo)纖毛軸質(zhì)微管去穩(wěn)定化和解聚合（圖 1.3）看，該過(guò)程首先是 G2 / M 期激酶 Plk1 磷酸化，激活解聚驅(qū)動(dòng)蛋白 Kif2延伸[38]。隨后 Ndel1 穩(wěn)定基底體中的 Trichoplein，與 Pitchfork 一起激活HEF1，進(jìn)而激活組蛋白去乙酰化酶 6（HDAC6）、促進(jìn)微管蛋白去乙酰致纖毛解聚（圖 1.3）。最后，在 S 期和 G2 期表達(dá)的 Nek2 與定位于與的解聚驅(qū)動(dòng)蛋白成員 Kif24 結(jié)合[39]，磷酸化并激活該第二解聚驅(qū)動(dòng)蛋白期開始后拆解過(guò)程的不可逆性，保證了中心粒能夠在 S 期復(fù)制并在 M 期裂紡錘體[35]（圖 1.3）。
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本文編號(hào)：2883490