發(fā)布時間：2018-07-13 20:13

【摘要】：研究背景和研究目的：肺癌(lung caneer)是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤,近年來肺癌的發(fā)病率和病死率迅速上升。由于肺癌對當前常用鉑類藥物易產(chǎn)生耐藥性,因此有必要研發(fā)新的鉑類替代藥物。Pt(0506)101是一種新合成的鉑類化合物,本實驗通過離體和整體實驗研究了Pt(0506)101的抗肺癌作用及機制。 方法： 1.整體試驗：建立裸鼠肺癌移植瘤模型,包括A549,H292等多種肺癌。Pt(0506)101尾靜脈注射給藥,每4天給藥1次,共5次。順鉑和卡鉑作為陽性對照藥。每3天測量小鼠體重及腫瘤體積1次。給藥結束后取腫瘤稱重,并拍照。 2.離體試驗：采用MTT法檢測Pt(0506)101對各種腫瘤細胞的體外細胞毒作用,流式細胞儀檢測Pt(0506)101作用后的肺癌細胞A549、H292的細胞周期、凋亡率的變化。 3.作用機制研究：1)在肺癌細胞A549、H292中加入不同濃度的Pt(0506)101,并以順鉑和卡鉑作為陽性對照藥,48h后檢測凋亡蛋白以及信號通路相關蛋白表達情況。2)A549細胞中p53基因特異性敲除后,western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達。3)JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)、Erkl/2抑制劑(U0126)以及P13K抑制劑(LY294002)干預A549細胞后,western blot法檢測Pt(0506)101誘導表達上升凋亡相關蛋白。4)超聲凍融法提取并測定Pt(0506)101作用后A549細胞內(nèi)GSH水平,并用流式細胞儀進一步檢測ROS的表達情況。用抗氧化劑NAC干預后,測定細胞凋亡率。 結果： 1.整體試驗結果：Pt(0506)101-30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg呈劑量依賴性地抑制裸鼠A549、H292肺癌移植瘤的生長,且與模型組比較有顯著性差異,A549的腫瘤抑制率分別為31.00%、47.03%、64.64%；H292的腫瘤抑制率分別為45.53%、53.79%、65.41%。Pt(0506)101抗肺癌作用略弱于順鉑DDP-6mg/kg,與卡鉑CBP-60mg/kg接近。 2.離體試驗結果：1)Pt(0506)101對A549、H292、H460等肺癌細胞株的細胞毒作用較強,雖然作用不及順鉑,卻明顯強于對卡鉑。對順鉑耐藥株A549/PPD的作用強度較順鉑強；而對正常肺上皮細胞株BEAS-2B,其作用強度比順鉑弱2倍,此外,Pt(0506)101對胃癌MGC-803, HGC-27具有很強的抗癌活性,提示Pt(0506)101在抗瘤作用方面有選擇性。2)100gM Pt(0506)101預處理肺癌細胞48h能顯著性促進A549,H292和LTEP-A-2三種肺癌細胞發(fā)生凋亡**(P0.01),其效果和10μM順鉑和200μM卡鉑作用相當。3)Pt(0506)101并不能引起肺癌細胞周期的改變,而陽性對照藥(順鉑和卡鉑)明顯增加A549、H292細胞株細胞周期S期的細胞比例,減少G1期的細胞比例。提示Pt(0506)101引起細胞凋亡與細胞周期的阻滯無關。 3.作用機制研究：1)Pt(0506)101呈濃度依賴上調(diào)p53、Fas、Bax等蛋白的表達,下調(diào)Bcl-2表達,顯著性地提高Bax/B1-2的比例。2)用siRNA方法特異性敲除A549細胞p53基因后能有效抑制Pt(0506)101誘導表達上升的Fas和Bax,結果證明p53可能位于Fas,Bax的上游發(fā)揮作用。3)Pt(0506)101能激活p-JNK蛋白表達,而且只有JNK抑制劑SP600125能顯著抑制Pt(0506)101誘導的凋亡蛋白的表達。提示Pt(0506)101可能通過SPAK/JNK信號通路誘發(fā)肺癌細胞凋亡。4)Pt(0506)101能顯著降低A549細胞內(nèi)GSH水平,升高ROS水平；抗氧化劑NAC干預后,能下調(diào)Pt(0506)101誘導表達上升的凋亡率。提示Pt(0506)101誘導升高細胞內(nèi)的活性氧可能是抑制或殺死癌細胞一個十分重要的啟動因子。 結論：綜上結果,Pt(0506)101尾靜脈注射給藥能抑制裸鼠肺癌移植瘤的生長。Pt(0506)101對肺癌細胞株具有較強的細胞毒活性；體外能誘導肺癌細胞發(fā)生凋亡。其作用機制可能通過激活ROS/JNK言號通路,上調(diào)凋亡相關蛋白p53, Fas, Bax,下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達,從而減少腫瘤血管生成,阻止細胞粘附,阻遏腫瘤細胞生長促進腫瘤細胞凋亡。
[Abstract]:Background and Objective : Lung cancer ( lung caneer ) is the most common primary malignant tumor of the lung , and the incidence and mortality of lung cancer have increased rapidly in recent years . Since lung cancer is susceptible to the current commonly used platinum drugs , it is necessary to develop new platinum substitute drugs . Pt ( 0506 ) 101 is a newly synthesized platinum compound . This experiment studied the anti - lung cancer function and mechanism of Pt ( 0506 ) 101 by ex vivo and integral experiments .

Method :

1 . Overall test : A model of nude mouse lung cancer transplantation tumor was established , including A549 , H292 and other lung cancer . Pt ( 0506 ) 101 tail vein injection , once every 4 days , 5 times . Cisplatin and carboplatin were used as positive control drugs . The weight of mice and tumor volume were measured once every 3 days . After the administration , tumor was weighed and photographed .

2 . ex vivo test : MTT assay was used to detect the cytotoxicity of Pt ( 0506 ) 101 on various tumor cells . Flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis rate of lung cancer cells A549 and H292 after the action of Pt ( 0506 ) 101 .

3 . Study on the mechanism of action : 1 ) In lung cancer cells A549 and H292 , different concentrations of Pt ( 0506 ) 101 were added and the expression of apoptotic proteins and related protein were detected after 48 hours .

Results :

1 . Overall test results : Pt ( 0506 ) 101 - 30 mg / kg , 60 mg / kg , 120 mg / kg inhibited the growth of nude mice A549 and H292 lung cancer , and had significant difference compared with model group , and the tumor inhibition rate of A549 was 31.00 % , 47.03 % and 64.64 % , respectively .
The tumor inhibition rate of H292 was 45.53 % , 53.79 % and 65.41 % , respectively . Pt ( 0506 ) 101 had a slightly weaker effect on lung cancer than DDP - 6 mg / kg DDP , which was close to carboplatin CBP - 60 mg / kg .

2 . The results of ex vivo test : 1 ) The cytotoxicity of Pt ( 0506 ) 101 on A549 , H292 , H460 and other lung cancer cells was stronger than that of cisplatin .
The effect of Pt ( 0506 ) 101 on gastric cancer MGC - 803 and HGC - 27 was significantly higher than that of cisplatin ( P < 0.01 ) .

3 . Study on the mechanism of action : 1 ) The expression of p53 , Fas , Bax , and the expression of Bax / B1 - 2 were downregulated by the concentration of Pt ( 0506 ) 101 . The expression of Fas and Bax induced by Pt ( 0506 ) 101 was significantly inhibited .
Anti - oxidant NAC intervention can downregulate the apoptosis rate of Pt ( 0506 ) 101 - induced expression . It suggests that Pt ( 0506 ) 101 can induce the increase of reactive oxygen in the cells , which may be a very important starting factor to inhibit or kill cancer cells .

Conclusion : In conclusion , Pt ( 0506 ) 101 tail vein injection can inhibit the growth of transplanted tumor in nude mice . Pt ( 0506 ) 101 has stronger cytotoxicity on lung cancer cell line .
It is possible to increase the expression of p53 , Fas , Bax and down - regulate the expression of apoptosis - inhibiting protein Bcl - 2 in lung cancer cells . The mechanism of action may decrease the expression of p53 , Fas , Bax and Bcl - 2 in lung cancer cells , thus reducing tumor angiogenesis , inhibiting cell adhesion , and inhibiting tumor cell growth and promote tumor cell apoptosis .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R734.2;R965

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本文編號：2120606