發(fā)布時間：2018-07-13 20:13

【摘要】：研究背景和研究目的：肺癌(lung caneer)是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤,近年來肺癌的發(fā)病率和病死率迅速上升。由于肺癌對當前常用鉑類藥物易產(chǎn)生耐藥性,因此有必要研發(fā)新的鉑類替代藥物。Pt(0506)101是一種新合成的鉑類化合物,本實驗通過離體和整體實驗研究了Pt(0506)101的抗肺癌作用及機制。 方法： 1.整體試驗：建立裸鼠肺癌移植瘤模型,包括A549,H292等多種肺癌。Pt(0506)101尾靜脈注射給藥,每4天給藥1次,共5次。順鉑和卡鉑作為陽性對照藥。每3天測量小鼠體重及腫瘤體積1次。給藥結束后取腫瘤稱重,并拍照。 2.離體試驗：采用MTT法檢測Pt(0506)101對各種腫瘤細胞的體外細胞毒作用,流式細胞儀檢測Pt(0506)101作用后的肺癌細胞A549、H292的細胞周期、凋亡率的變化。 3.作用機制研究：1)在肺癌細胞A549、H292中加入不同濃度的Pt(0506)101,并以順鉑和卡鉑作為陽性對照藥,48h后檢測凋亡蛋白以及信號通路相關蛋白表達情況。2)A549細胞中p53基因特異性敲除后,western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達。3)JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)、Erkl/2抑制劑(U0126)以及P13K抑制劑(LY294002)干預A549細胞后,western blot法檢測Pt(0506)101誘導表達上升凋亡相關蛋白。4)超聲凍融法提取并測定Pt(0506)101作用后A549細胞內GSH水平,并用流式細胞儀進一步檢測ROS的表達情況。用抗氧化劑NAC干預后,測定細胞凋亡率。 結果： 1.整體試驗結果：Pt(0506)101-30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg呈劑量依賴性地抑制裸鼠A549、H292肺癌移植瘤的生長,且與模型組比較有顯著性差異,A549的腫瘤抑制率分別為31.00%、47.03%、64.64%；H292的腫瘤抑制率分別為45.53%、53.79%、65.41%。Pt(0506)101抗肺癌作用略弱于順鉑DDP-6mg/kg,與卡鉑CBP-60mg/kg接近。 2.離體試驗結果：1)Pt(0506)101對A549、H292、H460等肺癌細胞株的細胞毒作用較強,雖然作用不及順鉑,卻明顯強于對卡鉑。對順鉑耐藥株A549/PPD的作用強度較順鉑強；而對正常肺上皮細胞株BEAS-2B,其作用強度比順鉑弱2倍,此外,Pt(0506)101對胃癌MGC-803, HGC-27具有很強的抗癌活性,提示Pt(0506)101在抗瘤作用方面有選擇性。2)100gM Pt(0506)101預處理肺癌細胞48h能顯著性促進A549,H292和LTEP-A-2三種肺癌細胞發(fā)生凋亡**(P0.01),其效果和10μM順鉑和200μM卡鉑作用相當。3)Pt(0506)101并不能引起肺癌細胞周期的改變,而陽性對照藥(順鉑和卡鉑)明顯增加A549、H292細胞株細胞周期S期的細胞比例,減少G1期的細胞比例。提示Pt(0506)101引起細胞凋亡與細胞周期的阻滯無關。 3.作用機制研究：1)Pt(0506)101呈濃度依賴上調p53、Fas、Bax等蛋白的表達,下調Bcl-2表達,顯著性地提高Bax/B1-2的比例。2)用siRNA方法特異性敲除A549細胞p53基因后能有效抑制Pt(0506)101誘導表達上升的Fas和Bax,結果證明p53可能位于Fas,Bax的上游發(fā)揮作用。3)Pt(0506)101能激活p-JNK蛋白表達,而且只有JNK抑制劑SP600125能顯著抑制Pt(0506)101誘導的凋亡蛋白的表達。提示Pt(0506)101可能通過SPAK/JNK信號通路誘發(fā)肺癌細胞凋亡。4)Pt(0506)101能顯著降低A549細胞內GSH水平,升高ROS水平；抗氧化劑NAC干預后,能下調Pt(0506)101誘導表達上升的凋亡率。提示Pt(0506)101誘導升高細胞內的活性氧可能是抑制或殺死癌細胞一個十分重要的啟動因子。 結論：綜上結果,Pt(0506)101尾靜脈注射給藥能抑制裸鼠肺癌移植瘤的生長。Pt(0506)101對肺癌細胞株具有較強的細胞毒活性；體外能誘導肺癌細胞發(fā)生凋亡。其作用機制可能通過激活ROS/JNK言號通路,上調凋亡相關蛋白p53, Fas, Bax,下調凋亡抑制蛋白Bcl-2表達,從而減少腫瘤血管生成,阻止細胞粘附,阻遏腫瘤細胞生長促進腫瘤細胞凋亡。
[Abstract]:Background and Objective : Lung cancer ( lung caneer ) is the most common primary malignant tumor of the lung , and the incidence and mortality of lung cancer have increased rapidly in recent years . Since lung cancer is susceptible to the current commonly used platinum drugs , it is necessary to develop new platinum substitute drugs . Pt ( 0506 ) 101 is a newly synthesized platinum compound . This experiment studied the anti - lung cancer function and mechanism of Pt ( 0506 ) 101 by ex vivo and integral experiments .

Method :

1 . Overall test : A model of nude mouse lung cancer transplantation tumor was established , including A549 , H292 and other lung cancer . Pt ( 0506 ) 101 tail vein injection , once every 4 days , 5 times . Cisplatin and carboplatin were used as positive control drugs . The weight of mice and tumor volume were measured once every 3 days . After the administration , tumor was weighed and photographed .

2 . ex vivo test : MTT assay was used to detect the cytotoxicity of Pt ( 0506 ) 101 on various tumor cells . Flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis rate of lung cancer cells A549 and H292 after the action of Pt ( 0506 ) 101 .

3 . Study on the mechanism of action : 1 ) In lung cancer cells A549 and H292 , different concentrations of Pt ( 0506 ) 101 were added and the expression of apoptotic proteins and related protein were detected after 48 hours .

Results :

1 . Overall test results : Pt ( 0506 ) 101 - 30 mg / kg , 60 mg / kg , 120 mg / kg inhibited the growth of nude mice A549 and H292 lung cancer , and had significant difference compared with model group , and the tumor inhibition rate of A549 was 31.00 % , 47.03 % and 64.64 % , respectively .
The tumor inhibition rate of H292 was 45.53 % , 53.79 % and 65.41 % , respectively . Pt ( 0506 ) 101 had a slightly weaker effect on lung cancer than DDP - 6 mg / kg DDP , which was close to carboplatin CBP - 60 mg / kg .

2 . The results of ex vivo test : 1 ) The cytotoxicity of Pt ( 0506 ) 101 on A549 , H292 , H460 and other lung cancer cells was stronger than that of cisplatin .
The effect of Pt ( 0506 ) 101 on gastric cancer MGC - 803 and HGC - 27 was significantly higher than that of cisplatin ( P < 0.01 ) .

3 . Study on the mechanism of action : 1 ) The expression of p53 , Fas , Bax , and the expression of Bax / B1 - 2 were downregulated by the concentration of Pt ( 0506 ) 101 . The expression of Fas and Bax induced by Pt ( 0506 ) 101 was significantly inhibited .
Anti - oxidant NAC intervention can downregulate the apoptosis rate of Pt ( 0506 ) 101 - induced expression . It suggests that Pt ( 0506 ) 101 can induce the increase of reactive oxygen in the cells , which may be a very important starting factor to inhibit or kill cancer cells .

Conclusion : In conclusion , Pt ( 0506 ) 101 tail vein injection can inhibit the growth of transplanted tumor in nude mice . Pt ( 0506 ) 101 has stronger cytotoxicity on lung cancer cell line .
It is possible to increase the expression of p53 , Fas , Bax and down - regulate the expression of apoptosis - inhibiting protein Bcl - 2 in lung cancer cells . The mechanism of action may decrease the expression of p53 , Fas , Bax and Bcl - 2 in lung cancer cells , thus reducing tumor angiogenesis , inhibiting cell adhesion , and inhibiting tumor cell growth and promote tumor cell apoptosis .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R734.2;R965

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本文編號：2120606