發(fā)布時間：2024-07-02 01:45

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的輸出是由外被體蛋白Ⅱ(coat protein complexⅡ,COPⅡ)包被的囊泡介導(dǎo)的,前期研究發(fā)現(xiàn)敲低COPⅡ運輸途徑的調(diào)控蛋白Rab1,豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的復(fù)制受到顯著的抑制,說明Rab1及其調(diào)控的運輸途徑在CSFV的復(fù)制過程中有重要作用。為了進(jìn)一步了解COPⅡ運輸途徑對CSFV復(fù)制的影響,探究COPⅡ蛋白轉(zhuǎn)運過程在CSFV復(fù)制中的作用,本研究利用COPⅡ途徑的抑制劑H89處理宿主細(xì)胞,在不同的時間點檢測CSFV RNA、E2蛋白以及病毒感染力的變化。過表達(dá)和干擾COPⅡ復(fù)合體中的蛋白Sar1b、Sec13和Sec23,并構(gòu)建相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,進(jìn)一步檢測COPⅡ運輸途徑對豬瘟病毒復(fù)制的影響并確定影響的關(guān)鍵蛋白,同時利用重疊延伸PCR構(gòu)建關(guān)鍵蛋白Sar1b的激活性突變體和失活性突變體,進(jìn)一步研究Sar1b對CSFV復(fù)制的影響,獲得以下研究結(jié)果:(1)COPⅡ蛋白Sar1b、Sec13和Sec23促進(jìn)CSFV的復(fù)制過程。成功構(gòu)建Sar1b、Sec13和Sec23基因的過表達(dá)細(xì)胞系,CSFV接種過表達(dá)細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-4重組質(zhì)粒pCDH-Sar1b、pCDH-Sec13和pCDH-Sec23轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后的熒光檢測Fig.2-4FluorescencedetectionofPK-15cellstransfectedwithrecombinantplasmidspCDH-Sar1b,pCDH-Sec13andpCDH-Sec23

外被體蛋白Ⅱ?qū)ωi瘟病毒復(fù)制的影響都有單一特異的FLAG條帶（圖2-5D、F）；Sar1b蛋白特異性抗體檢測顯示過表達(dá)中的蛋白表達(dá)量顯著高于對照細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量（圖2-5B）。說明PK-Sar1bK-Sec13和PK-Sec23穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系構(gòu)建成功，可以用于....

圖2-6CSFV在PK-Sar1b細(xì)胞系中復(fù)制檢測

外被體蛋白Ⅱ?qū)ωi瘟病毒復(fù)制的影響白表達(dá)量在24h和48h均顯著上升（P<0.05）（圖2-7）；PK-Sec23細(xì)胞接種CSF在感染早期CSFV的相對RNA復(fù)制量上升顯著（P<0.05或P<0.01），但36h和變化不顯著（P>0.05），E....

圖2-7CSFV在PK-Sec13細(xì)胞系中復(fù)制檢測Fig.2-7DetectionofCSFVreplicationinPK-Sec13cellline

A.real-timePCR檢測CSFV在PK-Sec13細(xì)胞系中的RNA相對表達(dá)量；B.Westernblot檢測PK-Sec13細(xì)胞系中的E2蛋白表達(dá)量；C.B中條帶的灰度分析A.real-timePCRdetectionofthe....

圖2-8CSFV在PK-Sec23細(xì)胞系中復(fù)制檢測Fig.2-8DetectionofCSFVreplicationinPK-Sec23cellline

A.real-timePCR檢測CSFV在PK-Sec23細(xì)胞系中的RNA相對表達(dá)量；B.Westernblot檢測PK-Sec23細(xì)胞系中的E2蛋白表達(dá)量；C.B中條帶的灰度分析A.real-timePCRdetectionofthe....

本文編號：3999505