【目的】建立檢測兔源強毒力金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的雙重PCR檢測方法,為兔葡萄球菌病的診斷提供技術(shù)支持�！痉椒ā扛鶕�(jù)兔源金黃色葡萄球菌的nuc和pvl兩種毒力基因的保守序列分別設(shè)計了兩對特異性引物進行雙重PCR擴增,對雙重PCR反應(yīng)體系的混合引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化,對雙重PCR檢測方法的特異性、敏感性和準確性進行驗證。【結(jié)果】當雙重PCR反應(yīng)體系混合引物的濃度為0.6μmol·L-1、退火溫度為59.6℃時,雙重PCR的擴增效果最優(yōu)。該雙重PCR檢測方法特異性好,能擴增出兔源強毒力金黃色葡萄球菌的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,對兔源多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等4種常見兔源細菌性病原菌以及陰性對照均無交叉反應(yīng)。該方法敏感性高,能分別檢出10 pg和100 fg的強毒力和低毒力兔源金黃色葡萄球菌基因組DNA。該方法重復性好,批內(nèi)和批間重復性試驗的變異系數(shù)均為0;該方法準確性好,對119份臨床樣品的檢測結(jié)果與已報道的檢測金黃色葡萄球菌nuc和pvl...

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【部分圖文】：

圖1單重PCR擴增結(jié)果

將強毒力菌株或低毒力菌株基因組DNA的量固定為100ng進行雙重PCR擴增，結(jié)果表明混合引物濃度為0.4μmol·L-1、退火溫度為58℃時能分別擴增出強毒力菌株的nuc和pvl基因片段和低毒力菌株的nuc基因片段（圖2）。在此基礎(chǔ)上，進一步對反應(yīng)體系中混合引物的濃度和退火溫度....

圖3雙重PCR檢測方法引物濃度優(yōu)化

圖2雙重PCR擴增結(jié)果圖4雙重PCR檢測方法退火溫度優(yōu)化

圖4雙重PCR檢測方法退火溫度優(yōu)化

圖3雙重PCR檢測方法引物濃度優(yōu)化2.3雙重PCR檢測方法的特異性

圖5雙重PCR檢測方法特異性

應(yīng)用建立的雙重PCR方法檢測3組已知結(jié)果的樣品（每組20份，共60份），重復3次，結(jié)果顯示，重復性試驗批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均為0，表明該雙重PCR方法具有良好的重復性。圖6雙重PCR檢測方法敏感性

本文編號：3987750