發(fā)布時(shí)間：2024-06-01 19:06

　　豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年首次于美國(guó)發(fā)現(xiàn)的一種新型豬圓環(huán)病毒。該病毒對(duì)處于各個(gè)年齡段的豬群均有較強(qiáng)的侵染性,特別是仔豬和處于妊娠期的母豬感染的幾率更高。PCV3引起豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔豬先天性震顫(congenital tremors,CT)、母豬繁殖障礙和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)等疾病,已經(jīng)在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在和流行。因此,對(duì)PCV3的檢測(cè)和防治相當(dāng)重要。本文根據(jù)PCV3Cap蛋白序列和大腸桿菌密碼子的偏愛性,對(duì)PCV3中Cap蛋白基因序列進(jìn)行優(yōu)化改造并合成。把合成的Cap蛋白基因片段和EGFP熒光蛋白基因片段相連接,作為目的基因插入pET28a載體質(zhì)粒的NcoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建成pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序和PCR擴(kuò)增鑒定正確后,轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中,并對(duì)其進(jìn)行IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和菌液的激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果分析可知,...

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬圓環(huán)病毒的研究進(jìn)展
        1.1.1 豬圓環(huán)病毒的研究背景
        1.1.2 豬圓環(huán)病毒的理化性質(zhì)
        1.1.3 豬圓環(huán)病毒的分子生物學(xué)特性
    1.2 豬圓環(huán)病毒的相關(guān)疾病與致病性研究
    1.3 豬圓環(huán)病毒的流行病學(xué)研究現(xiàn)狀
        1.3.1 豬圓環(huán)病毒在國(guó)外的流行情況
        1.3.2 豬圓環(huán)病毒在國(guó)內(nèi)的流行情況
    1.4 PCV3的檢測(cè)方法
        1.4.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        1.4.2 多重PCR法
        1.4.3 巢式PCR法
        1.4.4 熒光定量PCR法
        1.4.5 多重實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(mqPCR)
        1.4.6 實(shí)時(shí)重組酶聚合酶擴(kuò)增測(cè)試法(rt-RPA)
        1.4.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)
        1.4.8 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)
        1.4.9 免疫組織化學(xué)技術(shù)(HC)
    1.5 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒與菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1.1 PCV3-Cap-EGFP基因的優(yōu)化與合成
            2.2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.1.3 重組質(zhì)粒的合成
        2.2.2 重組質(zhì)粒質(zhì)粒的提取與鑒定
            2.2.2.1 重組質(zhì)粒的提取
            2.2.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
            2.2.3.1 IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響
            2.2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響
            2.2.3.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響
            2.2.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.2.4 重組質(zhì)粒菌液激光掃描共聚焦顯微鏡的觀察
        2.2.5 包涵體的分離與溶解
            2.2.5.1 包涵體的分離
            2.2.5.2 包涵體的洗滌
            2.2.5.3 包涵體的溶解
        2.2.6 包涵體的復(fù)性及復(fù)性后蛋白的濃縮
            2.2.6.1 包涵體的復(fù)性
            2.2.6.2 復(fù)性后蛋白的濃縮
        2.2.7 復(fù)性濃縮后蛋白激光掃描共聚焦顯微鏡的觀察
3 結(jié)果
    3.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒的提取鑒定結(jié)果
        3.1.2 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建后的質(zhì)粒圖譜
        3.1.3 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果
    3.2 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        3.2.1 IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響
        3.2.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響
        3.2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響
    3.3 重組質(zhì)粒菌液激光掃描共聚焦顯微鏡的觀察
    3.4 包涵體的分離溶解、復(fù)性和濃縮
    3.5 復(fù)性濃縮后蛋白激光掃描共聚焦顯微鏡的觀察
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄一
附錄二
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3986341