新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起的禽類傳染病,是一類動物疫病,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein,NP）作為NDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是抗NDV抗體檢測方法建立的主要靶抗原。納米抗體相比于傳統(tǒng)抗體具有分子量小,易于基因工程改造的優(yōu)點。為了建立NDV新型診斷技術(shù),本研究基于納米抗體的優(yōu)點,將其應(yīng)用于NDV新型診斷技術(shù)的研發(fā)中。本研究首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NDV的NP蛋白,將NDV-NP可溶性重組蛋白免疫雙峰駝,然后利用噬菌體展示技術(shù),通過3輪淘選,共篩到9株針對NP蛋白的特異性納米抗體。隨后,基于針對NDV-NP蛋白的納米抗體,建立了納米抗體—辣根過氧化物酶（HRP）融合蛋白制備平臺,然后將該融合蛋白用于開發(fā)雞血清中抗NDV抗體的競爭性ELISA（cELISA）檢測方法。1、NDV-NP重組蛋白的表達(dá)與純化構(gòu)建重組NDV-NP重組表達(dá)載體,Western blot和SDS-PAGE分析在56 kDa有預(yù)期大小的重組蛋白NDV-NP蛋白。2、抗NDV-... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 新城疫及納米抗體的研究概況
        1.1 新城疫的研究進(jìn)展
            1.1.1 新城疫概述
            1.1.2 新城疫病毒特點
            1.1.3 NDV編碼的主要蛋白特點
            1.1.4 NDV的傳播方式及感染途徑
            1.1.5 新城疫的診斷
            1.1.6 新城疫疫苗
        1.2 納米抗體研究進(jìn)展
            1.2.1 納米抗體概述及特點
            1.2.2 納米抗體的主要應(yīng)用
        1.3 研究目的及意義
試驗研究
    第二章 NDV-NP重組蛋白的表達(dá)與純化
        2.1 試驗材料與儀器設(shè)備
            2.1.1 載體和菌株
            2.1.2 主要試劑耗材
        2.2 試驗方法
            2.2.1 NDV-NP基因擴(kuò)增
            2.2.2 NP蛋白的表達(dá)及純化
        2.3 試驗結(jié)果
            2.3.1 原核表達(dá)載體PET-28A-NDV-N構(gòu)建
            2.3.2 HIS-NP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和與純化
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 抗NDV-NP蛋白納米抗體庫的構(gòu)建以及特異性納米抗體的篩選
        3.1 試驗材料
            3.1.1 質(zhì)粒、菌株與實驗動物
            3.1.2 主要試劑與材料
        3.2 試驗方法
            3.2.1 免疫雙峰駝
            3.2.2 納米抗體抗體文庫的構(gòu)建
            3.2.3 抗NP蛋白特異性納米抗體的淘選
        3.3 試驗結(jié)果
            3.3.1 抗NP蛋白抗體滴度測定
            3.3.2 納米抗體文庫的構(gòu)建
            3.3.3 篩選過程重組噬菌體的富集情況
            3.3.4 抗NP蛋白特異性納米抗體的ELISA鑒定
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 基于納米抗體-HRP融合蛋白雞血清中抗NDV抗體競爭ELISA檢測方法的建立
        4.1 試驗材料
            4.1.1 質(zhì)粒,菌株和細(xì)胞系
            4.1.2 主要試劑
            4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.2 試驗方法
            4.2.1 構(gòu)建PEGFP-N1-NDV-NP-NB5 真核載體
            4.2.2 真核表達(dá)NDV-NP-NB5 蛋白
            4.2.3 驗證NP蛋白與NDV-NP-NB5 的親和力
            4.2.4 確定NP與 NDV-NP-NB5 的最佳稀釋濃度
            4.2.5 確定競爭ELISA方法的血清稀釋度和孵育時間
            4.2.6 競爭ELISA方法檢測SPF雞血清確定CUT-OFF值
            4.2.7 建立競爭ELISA方法檢測臨床雞血清
        4.3 試驗結(jié)果
            4.3.1 PEGFP-NDV-NP-NB5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.3.2 NDV-NP-NB5 的表達(dá)以及與NDV-NP蛋白親和力的鑒定
            4.3.3 確定競爭ELISA的條件
            4.3.4 競爭ELISA方法檢測臨床雞血清
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號：2898206