長江三角洲白山羊毛囊干細胞的分離培養(yǎng)及CMTM3基因?qū)γ腋杉毎鲋车挠绊?/H1>
發(fā)布時間：2020-11-22 06:39
毛囊干細胞(Hair follicle stem cells)位于毛囊隆突部(Hair Bulge),屬于成體干細胞,具有多向分化潛能,是毛囊(Hair follicle)中的原始細胞,能通過自身的分裂增殖產(chǎn)生多種機體所需的細胞,與毛發(fā)周期的維持、皮膚組織的更新和損傷修復等密切相關(guān)。毛囊干細胞與毛囊周期狀態(tài)密切相關(guān),毛囊周期根據(jù)毛囊干細胞活躍程度和毛囊形態(tài)劃分為三個階段:生長期、退化期和休止期。目前分離毛囊干細胞的方法主要分為機械分離法和酶消化法,本研究比較了國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)毛囊干細胞分離純化的方法,通過對比實驗找到了兩種體外分離培養(yǎng)長江三角洲白山羊毛囊干細胞的方法,分別命名為“毛囊法”和“組織塊法”,通過比較兩種方法體外分離培養(yǎng)的毛囊干細胞細胞形態(tài)、細胞活力、復蘇存活率、克隆形成率以及毛囊干細胞標記物表達水平,找到了效果最好的方法。本研究還構(gòu)建了 CMTM3的過表達和干擾腺病毒載體,探究其在長江三角洲白山羊毛囊干細胞增殖過程中的生物學功能;同時我們還研究了生理濃度的雄激素(優(yōu)質(zhì)筆料毛個體血液中雄激素濃度)對于毛囊干細胞增殖的影響。本研究表明:(1)采用毛囊法分離培養(yǎng)的原代毛囊干細胞生長速度較快,增殖分裂狀態(tài)良好,呈現(xiàn)典型的鋪路石狀,毛囊干細胞標記物陽性率達到90%以上。組織塊法分離培養(yǎng)的毛囊干細胞在細胞活力、毛囊干細胞標記物陽性率等方面遜色于毛囊法,但是該方法操作簡單、方便。(2)提高CMTM3基因在毛囊干細胞中的表達水平后,DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HSPA1mRNA的表達水平顯著上升(P0.05);轉(zhuǎn)染干擾腺病毒載體并添加生理濃度的雄激素后DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HASP mRNA的表達水平顯著上升(P0.05),FLNA、FOS mRNA的表達水平顯著下降(P0.05)。(3)Western Blot檢測結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染過表達腺病毒載體后MAP3K1、DUSP1、FOS、HSPA1蛋白的表達水平顯著增強(P0.01),培養(yǎng)基中添加生理濃度的雄激素后MAP3K1、DUSP1蛋白表達水平顯著增強(P0.01);在轉(zhuǎn)染干擾載體后MAP3K1、DUSP6、HSPA1蛋白的表達水平顯著增強(P0.01)。(4)提高毛囊干細胞中CMTM3基因的水平可以使細胞活力下降,同時G1期的細胞比例顯著上升(P0.05),毛囊干細胞的凋亡率顯著上升(P0.05);轉(zhuǎn)染干擾腺病毒載體后細胞活力增強,S和G2期的細胞比例顯著上升;在培養(yǎng)基中單獨添加生理濃度的雄激素能使細胞活力增加,S和G2期的細胞比例顯著上升。表明抑制毛囊干細胞中CMTM3基因的表達和添加生理濃度的雄性激素都可以都促進毛囊干細胞的增殖,二者的作用相互協(xié)同。(5)雄性激素受體(AR)、表皮細胞生長因子(EGF)在優(yōu)質(zhì)筆料毛組的水平最高(P0.05),在去勢公羊組中最低,VEGFA、IGF-1在去勢公羊組中表達水平最高。推測高水平的EGF有利于長江三角洲白山羊優(yōu)質(zhì)筆料毛的產(chǎn)生,高水平的VEGFA、IGF-1可能會促使非優(yōu)質(zhì)筆料毛個體和去勢公羊產(chǎn)生普通的粗毛。綜上所述,本研究建立了兩種分離長江三角洲白山羊毛囊干細胞的方法,通過“毛囊法”體外分離培養(yǎng)的毛囊干細胞細胞活力更高并且毛囊干細胞標記物表達量最高。在毛囊干細胞中過表達或干擾CMTM3基因的表達水平可以影響毛囊干細胞中相關(guān)基因的表達水平,提高毛囊干細胞中CMTM3基因的表達水平可以抑制毛囊干細胞的增殖,促進細胞凋亡;抑制毛囊干細胞中CMTM3基因的表達水平可以促進毛囊干細胞的增殖,增加G2、S期細胞的比例,抑制細胞凋亡;在培養(yǎng)基中單獨添加生理濃度的雄激素也能促進毛囊干細胞的增殖;抑制毛囊干細胞中CMTM3基因的表達水平并添加生理濃度的雄激素對毛囊干細胞的促生長作用最為顯著。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：
但是髓質(zhì)層不是貫通于整根毛纖維，而是呈斷續(xù)狀態(tài)。一、二類毛分布范圍廣泛，??一般普通的山羊品種都能生成，而長江三角洲白山羊除生成一類、二類毛外，還能產(chǎn)生三??類毛。三類毛在羊體上有一定的著生部位，只著生在頸脊部，如圖１－１，ｆ所示。??１．３毛囊結(jié)構(gòu)及其功能??毛囊（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ）位于真皮層（Ｄｅｒｍａｌ丨ａｙｅｒ），是哺乳動物最為獨特和復雜的微型器官??之一ｌ３】，在解剖學上毛囊與其相鄰結(jié)構(gòu)汗腺（Ｓｗｅａｔ?ｇｌａｎｄｓ）、皮脂腺（Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ?ｇｌａｎｄ）和立??毛�。ǎ粒颍颍澹悖簦铮颍穑椋欤�?ｍｕｓｃｌｅ）構(gòu)成毛囊皮脂腺單位［３】，如圖１－２所示。??
?、一汗腺?靜脈??圖１－２毛囊結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??毛囊由２０種以上的細胞組成，每種細胞都有不同的功能，毛囊通過激素（Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）、??神經(jīng)肽（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）和免疫細胞（Ｉｍｍｕｎｅ?ｃｅｌｌｓ）１３１之間的復雜相互作用誘導毛囊產(chǎn)生不同??類型的毛囊細胞，進而調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長。在豎毛肌附近的毛囊外側(cè)有一個突出的部位，稱??為毛囊隆突（Ｈａｉｒ?ｂｌｕｇ），內(nèi)含毛囊干細胞（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ）。毛囊的上皮組織包括內(nèi)根??
對于羊毛生長調(diào)節(jié)機制、毛囊生長規(guī)律等研究有著重要的作用。??２．２材料與方法??本小節(jié)實驗路線流程如圖２－１所示。??２．２．１實驗材料??本試驗的山羊來源于海門市海門山羊種羊場，選取１２０胎齡左右的雄性胎羊頸背部的??皮膚，先用手術(shù)刀刮干凈表面的羊毛，酒精消毒，用手術(shù)刀割下２ｃｍ?ｘ?２ｃｍ大小的完好皮??膚組織，該皮膚組織樣包含表皮層、真皮層、皮下結(jié)締組織。用生理鹽水洗凈，７５％酒精??
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1 ;中國毛囊干細胞研究領(lǐng)域——著名專家介紹[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年49期
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5 仇文穎;許增祿;徐園園;;成人毛囊干細胞分選及β-連環(huán)蛋白表達的研究[J];解剖學報;2006年02期
6 華云旗;李秀蘭;張楊;;微環(huán)境調(diào)控毛囊干細胞增殖與分化的研究進展(綜述)[J];生物醫(yī)學工程與臨床;2006年S1期
7 朱培成;禤國維;范瑞強;;毛囊干細胞研究進展[J];嶺南皮膚性病科雜志;2006年04期
8 劉本;陳賢燕;易寰;韓樂;鄧文佳;萬苗堅;;齊墩果酸對體外培養(yǎng)人毛囊干細胞增殖的影響[J];皮膚性病診療學雜志;2017年02期
9 全仁夫;鄭宣;許世超;倪月明;謝尚舉;李長明;;大鼠毛囊干細胞體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染方法[J];中醫(yī)正骨;2014年06期
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本文編號：2894290
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【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S827
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但是髓質(zhì)層不是貫通于整根毛纖維，而是呈斷續(xù)狀態(tài)。一、二類毛分布范圍廣泛，??一般普通的山羊品種都能生成，而長江三角洲白山羊除生成一類、二類毛外，還能產(chǎn)生三??類毛。三類毛在羊體上有一定的著生部位，只著生在頸脊部，如圖１－１，ｆ所示。??１．３毛囊結(jié)構(gòu)及其功能??毛囊（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ）位于真皮層（Ｄｅｒｍａｌ丨ａｙｅｒ），是哺乳動物最為獨特和復雜的微型器官??之一ｌ３】，在解剖學上毛囊與其相鄰結(jié)構(gòu)汗腺（Ｓｗｅａｔ?ｇｌａｎｄｓ）、皮脂腺（Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ?ｇｌａｎｄ）和立??毛�。ǎ粒颍颍澹悖簦铮颍穑椋欤�?ｍｕｓｃｌｅ）構(gòu)成毛囊皮脂腺單位［３】，如圖１－２所示。??
?、一汗腺?靜脈??圖１－２毛囊結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??毛囊由２０種以上的細胞組成，每種細胞都有不同的功能，毛囊通過激素（Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）、??神經(jīng)肽（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）和免疫細胞（Ｉｍｍｕｎｅ?ｃｅｌｌｓ）１３１之間的復雜相互作用誘導毛囊產(chǎn)生不同??類型的毛囊細胞，進而調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長。在豎毛肌附近的毛囊外側(cè)有一個突出的部位，稱??為毛囊隆突（Ｈａｉｒ?ｂｌｕｇ），內(nèi)含毛囊干細胞（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ）。毛囊的上皮組織包括內(nèi)根??
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本文編號：2894290
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